Lai efektīvikontrolēt odusun samazināt to pārnēsāto slimību sastopamību, ir nepieciešamas stratēģiskas, ilgtspējīgas un videi draudzīgas alternatīvas ķīmiskajiem pesticīdiem. Mēs novērtējām dažu Brassicaceae (Brassica dzimta) sēklu miltus kā augu izcelsmes izotiocianātu avotu, kas iegūti, veicot bioloģiski neaktīvu glikozinolātu fermentatīvu hidrolīzi, lai tos izmantotu Ēģiptes Aedes (L., 1762) kontrolei. Piecu pakāpju attaukoti sēklu milti (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 un Thlaspi arvense – trīs galvenie termiskās inaktivācijas un fermentatīvās noārdīšanās veidi). Ķīmiskie produkti. Lai noteiktu alilizotiocianāta, benzilizotiocianāta un 4-hidroksibenzilizotiocianāta toksicitāti (LC50) Aedes aegypti kāpuriem 24 stundu iedarbībā = 0,04 g/120 ml dH2O). Sinepju, balto sinepju un kosas sēklu miltu LC50 vērtības bija attiecīgi 0,05, 0,08 un 0,05, salīdzinot ar alilizotiocianātu (LC50 = 19,35 ppm) un 4-hidroksibenzilizotiocianātu (LC50 = 55,41 ppm), kas bija toksiskāks kāpuriem 24 stundas pēc apstrādes nekā 0,1 g/120 ml dH2O. Šie rezultāti atbilst lucernas sēklu miltu ražošanas rezultātiem. Benzilesteru augstāka efektivitāte atbilst aprēķinātajām LC50 vērtībām. Sēklu miltu izmantošana var nodrošināt efektīvu odu apkarošanas metodi. Krustziežu sēklu pulvera un tā galveno ķīmisko komponentu efektivitāte pret odu kāpuriem parāda, kā dabiskie savienojumi krustziežu sēklu pulverī var kalpot kā daudzsološs videi draudzīgs larvicīds odu apkarošanai.
Vektoru pārnēsātas slimības, ko izraisa Aedes odi, joprojām ir nopietna globāla sabiedrības veselības problēma. Odu pārnēsāto slimību izplatība ģeogrāfiski izplatās1,2,3 un atkārtoti parādās, izraisot smagu slimību uzliesmojumus4,5,6,7. Slimību izplatība cilvēku un dzīvnieku vidū (piemēram, čikungunja, denges drudzis, Rifta ielejas drudzis, dzeltenais drudzis un Zikas vīruss) ir nepieredzēta. Vienīgi denges drudzis tropos pakļauj aptuveni 3,6 miljardus cilvēku inficēšanās riskam, un tiek lēsts, ka katru gadu notiek 390 miljoni inficēšanās gadījumu, kā rezultātā katru gadu notiek 6100–24 300 nāves gadījumu8. Zikas vīrusa atkārtota parādīšanās un uzliesmojums Dienvidamerikā ir piesaistījis pasaules uzmanību smadzeņu bojājumu dēļ, ko tas izraisa bērniem, kas dzimuši inficētām sievietēm2. Krēmers un līdzautori3 prognozē, ka Aedes odu ģeogrāfiskais izplatības areāls turpinās paplašināties un ka līdz 2050. gadam pusei pasaules iedzīvotāju būs risks inficēties ar odu pārnēsātiem arbovīrusiem.
Izņemot nesen izstrādātās vakcīnas pret denges drudzi un dzelteno drudzi, vakcīnas pret lielāko daļu odu pārnēsātu slimību vēl nav izstrādātas9,10,11. Vakcīnas joprojām ir pieejamas ierobežotā daudzumā un tiek izmantotas tikai klīniskajos pētījumos. Odu pārnēsātāju kontrole, izmantojot sintētiskus insekticīdus, ir bijusi galvenā stratēģija odu pārnēsātu slimību izplatības kontrolei12,13. Lai gan sintētiskie pesticīdi ir efektīvi odu iznīcināšanā, sintētisko pesticīdu nepārtraukta lietošana negatīvi ietekmē nemērķa organismus un piesārņo vidi14,15,16. Vēl satraucošāka ir tendence palielināt odu izturību pret ķīmiskajiem insekticīdiem17,18,19. Šīs ar pesticīdiem saistītās problēmas ir paātrinājušas efektīvu un videi draudzīgu alternatīvu meklēšanu slimību pārnēsātāju kontrolei.
Kā fitopesticīdu avoti kaitēkļu apkarošanai ir izstrādāti dažādi augi20,21. Augu vielas parasti ir videi draudzīgas, jo tās ir bioloģiski noārdāmas un tām ir zema vai niecīga toksicitāte nemērķa organismiem, piemēram, zīdītājiem, zivīm un abiniekiem20,22. Ir zināms, ka augu izcelsmes preparāti ražo dažādus bioaktīvus savienojumus ar dažādiem darbības mehānismiem, lai efektīvi kontrolētu dažādus odu dzīves posmus23,24,25,26. No augiem iegūti savienojumi, piemēram, ēteriskās eļļas un citas aktīvās augu sastāvdaļas, ir piesaistījuši uzmanību un pavēruši ceļu inovatīviem līdzekļiem odu vektoru kontrolei. Ēteriskās eļļas, monoterpēni un seskviterpēni darbojas kā repelenti, barošanās atturētāji un ovicīdi27,28,29,30,31,32,33. Daudzas augu eļļas izraisa odu kāpuru, kūniņu un pieaugušo īpatņu nāvi34,35,36, ietekmējot kukaiņu nervu, elpošanas, endokrīno un citas svarīgas sistēmas37.
Jaunākie pētījumi ir snieguši ieskatu sinepju augu un to sēklu potenciālajā izmantošanā kā bioaktīvo savienojumu avotu. Sinepju sēklu milti ir testēti kā biofumigants38,39,40,41 un izmantoti kā augsnes uzlabotājs nezāļu nomākšanai42,43,44 un augsnē esošo augu patogēnu45,46,47,48,49,50, augu barošanai, nematodu41,51, 52, 53, 54 un kaitēkļu55, 56, 57, 58, 59, 60 kontrolei. Šo sēklu pulveru fungicīdu aktivitāti attiecina uz augu aizsargsavienojumiem, ko sauc par izotiocianātiem38,42,60. Augos šie aizsargsavienojumi tiek uzglabāti augu šūnās nebioaktīvu glikozinolātu veidā. Tomēr, kad augus bojā kukaiņu barošanās vai patogēnu infekcija, mirozināze hidrolizē glikozinolātus par bioaktīviem izotiocianātiem55,61. Izotiocianāti ir gaistoši savienojumi, kas zināmi ar plaša spektra pretmikrobu un insekticīdu aktivitāti, un to struktūra, bioloģiskā aktivitāte un saturs dažādās Brassicaceae sugās ievērojami atšķiras42,59,62,63.
Lai gan ir zināms, ka no sinepju sēklu miltiem iegūtajiem izotiocianātiem piemīt insekticīda aktivitāte, trūkst datu par bioloģisko aktivitāti pret medicīniski nozīmīgiem posmkāju vektoriem. Mūsu pētījumā tika pārbaudīta četru attaukotu sēklu pulveru larvicīdā aktivitāte pret Aedes odiem. Aedes aegypti kāpuri. Pētījuma mērķis bija novērtēt to potenciālo izmantošanu kā videi draudzīgus biopesticīdus odu kontrolei. Tika pārbaudītas arī trīs galvenās sēklu miltu ķīmiskās sastāvdaļas - alilizotiocianāts (AITC), benzilizotiocianāts (BITC) un 4-hidroksibenzilizotiocianāts (4-HBITC), lai pārbaudītu šo ķīmisko komponentu bioloģisko aktivitāti pret odu kāpuriem. Šis ir pirmais ziņojums, kurā novērtēta četru kāpostu sēklu pulveru un to galveno ķīmisko komponentu efektivitāte pret odu kāpuriem.
Aedes aegypti (Rokfellera celms) laboratorijas kolonijas tika turētas 26°C temperatūrā, 70% relatīvajā mitrumā (RH) un 10:14 h (L:D fotoperiods). Pārojamās mātītes tika izmitinātas plastmasas būros (augstums 11 cm un diametrs 9,5 cm) un barotas caur pudeles barošanas sistēmu, izmantojot citrāta liellopu asinis (HemoStat Laboratories Inc., Diksona, Kalifornija, ASV). Asins barošana tika veikta kā parasti, izmantojot membrānas daudzstiklu barotavu (Chemglass, Life Sciences LLC, Vainlenda, Ņūdžersija, ASV), kas savienota ar cirkulējošas ūdens vannas cauruli (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, Masačūsetsa, ASV) ar temperatūras kontroli 37°C. Uz katras stikla barošanas kameras apakšas (laukums 154 mm2) uzstiept Parafilm M plēvi. Pēc tam katra barotava tika novietota uz augšējā režģa, kas pārklāja būri, kurā atradās pārojošā mātīte. Aptuveni 350–400 μl liellopu asiņu tika pievienotas stikla padeves piltuvei, izmantojot Pastēra pipeti (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV), un pieaugušajiem tārpiem ļāva notecēt vismaz vienu stundu. Pēc tam grūsnām mātītēm deva 10% saharozes šķīdumu un ļāva dēt olas uz mitra filtrpapīra, kas izklāts individuālās īpaši caurspīdīgās suflē krūzītēs (1,25 šķidruma unces lielumā, Dart Container Corp., Mason, MI, ASV). Ievietojiet filtrpapīru ar olām noslēgtā maisiņā (SC Johnsons, Racine, WI) un uzglabājiet 26°C temperatūrā. Olas tika izperētas, un aptuveni 200–250 kāpuri tika izaudzēti plastmasas paplātēs, kas saturēja trušu barības (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ASV) un aknu pulvera (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ASV) un zivju filejas (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Vācija) maisījumu attiecībā 2:1:1. Mūsu biotestos tika izmantoti vēlīnā trešās stadijas kāpuri.
Šajā pētījumā izmantotais augu sēklu materiāls tika iegūts no šādiem komerciāliem un valdības avotiem: Brassica juncea (brūnās sinepes — Pacific Gold) un Brassica juncea (baltās sinepes — Ida Gold) no Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Vašingtonas štats, ASV; (dārza kressalāti) no Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, Ilinoisa, ASV un Thlaspi arvense (lauka penikreses — Elisabeth) no USDA-ARS, Peoria, Ilinoisa, ASV; Neviena no pētījumā izmantotajām sēklām netika apstrādāta ar pesticīdiem. Viss sēklu materiāls šajā pētījumā tika apstrādāts un izmantots saskaņā ar vietējiem un valsts noteikumiem un ievērojot visus attiecīgos vietējos, štatu un valsts noteikumus. Šajā pētījumā netika pārbaudītas transgēnās augu šķirnes.
Brassica juncea (PG), lucernas (Ls), balto sinepju (IG) un Thlaspi arvense (DFP) sēklas tika samaltas smalkā pulverī, izmantojot Retsch ZM200 ultracentrbēdzes dzirnavas (Retsch, Haan, Vācija), kas aprīkotas ar 0,75 mm sietu un nerūsējošā tērauda rotoru, 12 zobiem, 10 000 apgr./min (1. tabula). Sasmalcināto sēklu pulveri pārnesa uz papīra uzmavu un attaukoja ar heksānu Sokleta aparātā 24 stundas. Attaukotu lauka sinepju apakšparaugs tika termiski apstrādāts 100 °C temperatūrā 1 stundu, lai denaturētu mirozināzi un novērstu glikozinolātu hidrolīzi, veidojot bioloģiski aktīvus izotiocianātus. Termiski apstrādāts kosas sēklu pulveris (DFP-HT) tika izmantots kā negatīva kontrole, denaturējot mirozināzi.
Attaukotu sēklu miltu glikozinolāta saturs tika noteikts trīs reizes, izmantojot augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC) saskaņā ar iepriekš publicētu protokolu 64. Īsumā, 250 mg attaukota sēklu pulvera paraugam pievienoja 3 ml metanola. Katru paraugu 30 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu ūdens vannā un 16 stundas atstāja tumsā 23°C temperatūrā. Pēc tam 1 ml organiskā slāņa alikvota tika filtrēta caur 0,45 μm filtru automātiskajā paraugu ņemšanas ierīcē. Darbojoties ar Shimadzu HPLC sistēmu (divi LC 20AD sūkņi; SIL 20A automātiskais paraugu ņemšanas ierīce; DGU 20A degazētājs; SPD-20A UV-VIS detektors monitoringam pie 237 nm; un CBM-20A komunikācijas kopnes modulis), sēklu miltu glikozinolāta saturs tika noteikts trīs reizes, izmantojot Shimadzu LC Solution programmatūras 1.25 versiju (Shimadzu Corporation, Kolumbija, MD, ASV). Kolonna bija C18 Inertsil apgrieztās fāzes kolonna (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ASV). Sākotnējie mobilās fāzes apstākļi tika iestatīti uz 12% metanola/88% 0,01 M tetrabutilamonija hidroksīda ūdenī (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) ar plūsmas ātrumu 1 ml/min. Pēc 15 μl parauga ievadīšanas sākotnējie apstākļi tika uzturēti 20 minūtes, un pēc tam šķīdinātāja attiecība tika noregulēta uz 100% metanola, kopējam parauga analīzes laikam esot 65 minūtēm. Standarta līkne (pamatojoties uz nM/mAb) tika ģenerēta, izmantojot svaigi pagatavotu sinapīna, glikozinolāta un mirozīna standartu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV) sērijveida atšķaidījumus, lai novērtētu attaukotu sēklu miltu sēra saturu. glikozinolāti. Glikozinolāta koncentrācijas paraugos tika pārbaudītas ar Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, ASV), izmantojot OpenLAB CDS ChemStation versiju (C.01.07 SR2 [255]), kas aprīkota ar to pašu kolonnu un iepriekš aprakstītu metodi. Glikozinolāta koncentrācijas tika noteiktas; tām jābūt salīdzināmām starp HPLC sistēmām.
Alilizotiocianāts (94%, stabils) un benzilizotiocianāts (98%) tika iegādāti no Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV). 4-hidroksibenzilizotiocianāts tika iegādāts no ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, ASV). Enzīmu hidrolizējot ar mirozināzi, glikozinolāti, glikozinolāti un glikozinolāti veido attiecīgi alilizotiocianātu, benzilizotiocianātu un 4-hidroksibenzilizotiocianātu.
Laboratorijas bioanalīzes tika veiktas saskaņā ar Muturi et al. metodi 32 ar modifikācijām. Pētījumā tika izmantotas piecas zema tauku satura sēklu barības: DFP, DFP-HT, IG, PG un Ls. Divdesmit kāpuri tika ievietoti 400 ml vienreizējās lietošanas trīsceļu vārglāzē (VWR International, LLC, Radnor, PA, ASV), kas saturēja 120 ml dejonizēta ūdens (dH2O). Odu kāpuru toksicitātes noteikšanai tika pārbaudītas septiņas sēklu miltu koncentrācijas: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 un 0,12 g sēklu miltu/120 ml dH2O DFP sēklu miltiem, DFP-HT, IG un PG. Sākotnējās bioanalīzes liecina, ka attaukoti Ls sēklu milti ir toksiskāki nekā četri citi testētie sēklu milti. Tāpēc mēs pielāgojām septiņas Ls sēklu miltu apstrādes koncentrācijas šādām koncentrācijām: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 un 0,075 g/120 ml dH2O.
Lai novērtētu normālu kukaiņu mirstību testa apstākļos, tika iekļauta neapstrādāta kontroles grupa (dH20, bez sēklu miltu piedevas). Katras sēklu miltu toksikoloģiskās bioanalīzes ietvēra trīs atkārtotas trīsslīpju mērglāzes (20 vēlīnā trešās stadijas kāpuri katrā mērglāzē), kopā 108 flakonus. Apstrādātie trauki tika uzglabāti istabas temperatūrā (20–21 °C), un kāpuru mirstība tika reģistrēta 24 un 72 stundu nepārtrauktas iedarbības laikā ar apstrādes koncentrācijām. Ja oda ķermenis un piedēkļi nekustas, kad tos caurdur vai pieskaras ar plānu nerūsējošā tērauda lāpstiņu, odu kāpuri tiek uzskatīti par mirušiem. Mirušie kāpuri parasti paliek nekustīgi muguras vai vēdera stāvoklī trauka apakšā vai uz ūdens virsmas. Eksperiments tika atkārtots trīs reizes dažādās dienās, izmantojot dažādas kāpuru grupas, kopā 180 kāpuriem, kas tika pakļauti katrai apstrādes koncentrācijai.
AITC, BITC un 4-HBITC toksicitāte odu kāpuriem tika novērtēta, izmantojot to pašu bioanalīzes procedūru, bet ar atšķirīgu apstrādi. Katrai ķīmiskajai vielai sagatavoja 100 000 ppm standarta šķīdumus, pievienojot 100 µL ķīmiskās vielas 900 µL absolūtā etanola 2 ml centrifūgas mēģenē un kratot 30 sekundes, lai rūpīgi sajauktos. Apstrādes koncentrācijas tika noteiktas, pamatojoties uz mūsu sākotnējām bioanalīzes metodēm, kurās tika konstatēts, ka BITC ir daudz toksiskāks nekā AITC un 4-HBITC. Lai noteiktu toksicitāti, tika izmantotas 5 BITC koncentrācijas (1, 3, 6, 9 un 12 ppm), 7 AITC koncentrācijas (5, 10, 15, 20, 25, 30 un 35 ppm) un 6 4-HBITC koncentrācijas (15, 15, 20, 25, 30 un 35 ppm), 30, 45, 60, 75 un 90 ppm). Kontroles grupai tika injicēti 108 μL absolūtā etanola, kas ir līdzvērtīgs ķīmiskās apstrādes maksimālajam tilpumam. Bioanalīzes tika atkārtotas, kā aprakstīts iepriekš, pakļaujot kopumā 180 kāpurus katrai apstrādes koncentrācijai. Kāpuru mirstība tika reģistrēta katrai AITC, BITC un 4-HBITC koncentrācijai pēc 24 stundu nepārtrauktas iedarbības.
Izmantojot Polo programmatūru (Polo Plus, LeOra Software, 1.0 versija), tika veikta 65 ar devu saistītu mirstības datu probita analīze, lai aprēķinātu 50% letālo koncentrāciju (LC50), 90% letālo koncentrāciju (LC90), slīpumu, letālās devas koeficientu un 95% letālo koncentrāciju, pamatojoties uz letālo devu attiecību ticamības intervāliem logaritmiski pārveidotām koncentrācijas un devas-mirstības līknēm. Mirstības dati ir balstīti uz kombinētiem atkārtotiem datiem par 180 kāpuriem, kas pakļauti katrai apstrādes koncentrācijai. Varbūtības analīzes tika veiktas atsevišķi katram sēklu miltiem un katram ķīmiskajam komponentam. Pamatojoties uz letālās devas attiecības 95% ticamības intervālu, sēklu miltu un ķīmisko sastāvdaļu toksicitāte odu kāpuriem tika uzskatīta par būtiski atšķirīgu, tāpēc ticamības intervāls ar vērtību 1 nebija būtiski atšķirīgs, P = 0,0566.
AŠH rezultāti galveno glikozinolātu noteikšanai attaukotos sēklu miltos DFP, IG, PG un Ls ir uzskaitīti 1. tabulā. Galveno glikozinolātu saturs testētajos sēklu miltos atšķīrās, izņemot DFP un PG, kas abi saturēja mirozināzes glikozinolātus. Mirozinīna saturs PG bija augstāks nekā DFP, attiecīgi 33,3 ± 1,5 un 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls sēklu pulveris saturēja 36,6 ± 1,2 mg/g glikoglikona, savukārt IG sēklu pulveris saturēja 38,0 ± 0,5 mg/g sinapīna.
Ae. Aedes aegypti odu kāpuri tika nogalināti, apstrādājot tos ar attaukotu sēklu miltu maisījumu, lai gan apstrādes efektivitāte atšķīrās atkarībā no augu sugas. Tikai DFP-NT nebija toksisks odu kāpuriem pēc 24 un 72 stundu iedarbības (2. tabula). Aktīvā sēklu pulvera toksicitāte palielinājās, palielinoties koncentrācijai (1.A, B att.). Sēklu miltu toksicitāte odu kāpuriem būtiski atšķīrās, pamatojoties uz LC50 vērtību letālās devas attiecības 95% ticamības intervālu 24 stundu un 72 stundu novērtējumos (3. tabula). Pēc 24 stundām Ls sēklu miltu toksiskā iedarbība bija lielāka nekā citām sēklu miltu apstrādes metodēm, ar visaugstāko aktivitāti un maksimālo toksicitāti kāpuriem (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Kāpuri 24 stundu laikā bija mazāk jutīgi pret DFP, salīdzinot ar IG, Ls un PG sēklu pulvera apstrādi, ar LC50 vērtībām attiecīgi 0,115, 0,04 un 0,08 g/120 ml dH2O, kas bija statistiski augstākas par LC50 vērtību 0,211 g/120 ml dH2O (3. tabula). DFP, IG, PG un Ls LC90 vērtības bija attiecīgi 0,376, 0,275, 0,137 un 0,074 g/120 ml dH2O (2. tabula). Visaugstākā DPP koncentrācija bija 0,12 g/120 ml dH2O. Pēc 24 stundu novērtēšanas vidējā kāpuru mirstība bija tikai 12 %, savukārt IG un PG kāpuru vidējā mirstība sasniedza attiecīgi 51 % un 82 %. Pēc 24 stundu novērtēšanas vidējā kāpuru mirstība pēc augstākās Ls sēklu miltu apstrādes koncentrācijas (0,075 g/120 ml dH2O) bija 99% (1.A att.).
Mirstības līknes tika aprēķinātas no Ae. Egyptian larvae (3. instāra kāpuri) devas-atbildes attiecības (Probit) uz sēklu miltu koncentrāciju 24 stundas (A) un 72 stundas (B) pēc apstrādes. Punktētā līnija attēlo sēklu miltu apstrādes LC50. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Termiski inaktivēta Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
72 stundu novērtējumā DFP, IG un PG sēklu miltu LC50 vērtības bija attiecīgi 0,111, 0,085 un 0,051 g/120 ml dH2O. Gandrīz visi kāpuri, kas bija pakļauti Ls sēklu miltiem, nomira pēc 72 stundu iedarbības, tāpēc mirstības dati neatbilda Probit analīzei. Salīdzinot ar citiem sēklu miltiem, kāpuri bija mazāk jutīgi pret DFP sēklu miltu apstrādi un tiem bija statistiski augstākas LC50 vērtības (2. un 3. tabula). Pēc 72 stundām DFP, IG un PG sēklu miltu apstrādes LC50 vērtības tika aprēķinātas attiecīgi 0,111, 0,085 un 0,05 g/120 ml dH2O. Pēc 72 stundu novērtēšanas DFP, IG un PG sēklu pulveru LC90 vērtības bija attiecīgi 0,215, 0,254 un 0,138 g/120 ml dH2O. Pēc 72 stundu ilgas novērtēšanas vidējā kāpuru mirstība DFP, IG un PG sēklu miltu apstrādē ar maksimālo koncentrāciju 0,12 g/120 ml dH2O bija attiecīgi 58%, 66% un 96% (1.B att.). Pēc 72 stundu ilgas novērtēšanas tika konstatēts, ka PG sēklu milti ir toksiskāki nekā IG un DFP sēklu milti.
Sintētiskie izotiocianāti, alilizotiocianāts (AITC), benzilizotiocianāts (BITC) un 4-hidroksibenzilizotiocianāts (4-HBITC) var efektīvi iznīcināt odu kāpurus. 24 stundas pēc apstrādes BITC bija toksiskāks kāpuriem ar LC50 vērtību 5,29 ppm, salīdzinot ar 19,35 ppm AITC un 55,41 ppm 4-HBITC (4. tabula). Salīdzinot ar AITC un BITC, 4-HBITC ir zemāka toksicitāte un augstāka LC50 vērtība. Pastāv būtiskas atšķirības starp divu galveno izotiocianātu (Ls un PG) toksicitāti odu kāpuriem visspēcīgākajā sēklu miltos. Toksicitāte, pamatojoties uz LC50 vērtību letālās devas attiecību starp AITC, BITC un 4-HBITC, uzrādīja statistisku atšķirību, piemēram, LC50 letālās devas attiecības 95% ticamības intervālā nebija iekļauta vērtība 1 (P = 0,05, 4. tabula). Tika lēsts, ka augstākās gan BITC, gan AITC koncentrācijas nogalina 100% testēto kāpuru (2. attēls).
Mirstības līknes tika aprēķinātas, izmantojot Ae devas un atbildes reakcijas attiecību (Probit). 24 stundas pēc apstrādes Ēģiptes kāpuri (3. stadijas kāpuri) sasniedza sintētiskā izotiocianāta koncentrāciju. Punktētā līnija apzīmē LC50 pēc apstrādes ar izotiocianātu. Benzilizotiocianāts BITC, alilizotiocianāts AITC un 4-HBITC.
Augu biopesticīdu izmantošana kā odu pārnēsātāju kontroles līdzekļi ir pētīta jau sen. Daudzi augi ražo dabiskas ķīmiskas vielas, kurām piemīt insekticīda aktivitāte37. To bioaktīvie savienojumi ir pievilcīga alternatīva sintētiskajiem insekticīdiem ar lielu potenciālu kaitēkļu, tostarp odu, apkarošanā.
Sinepju augus audzē kā kultūraugu to sēklu dēļ, izmanto kā garšvielu un eļļas avotu. Kad no sēklām iegūst sinepju eļļu vai kad sinepes iegūst izmantošanai kā biodegvielu,69 blakusprodukts ir attaukoti sēklu milti. Šie sēklu milti saglabā daudzas no savām dabiskajām bioķīmiskajām sastāvdaļām un hidrolītiskajiem enzīmiem. Šo sēklu miltu toksicitāte tiek attiecināta uz izotiocianātu ražošanu55,60,61. Izotiocianāti veidojas glikozinolātu hidrolīzes rezultātā ar enzīmu mirozināzi sēklu miltu hidratācijas laikā38,55,70, un ir zināms, ka tiem piemīt fungicīda, baktericīda, nematocīda un insekticīda iedarbība, kā arī citas īpašības, tostarp ķīmiski sensoriska iedarbība un ķīmijterapeitiskas īpašības61,62,70. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka sinepju augi un sēklu milti efektīvi darbojas kā fumiganti pret augsnes un uzglabāto pārtikas produktu kaitēkļiem57,59,71,72. Šajā pētījumā mēs novērtējām četru sēklu miltu un to trīs bioaktīvo produktu AITC, BITC un 4-HBITC toksicitāti Aedes odu kāpuriem. Aedes aegypti. Paredzams, ka sēklu miltu tieša pievienošana ūdenim, kurā ir odu kāpuri, aktivizēs fermentatīvos procesus, kas rada izotiocianātus, kas ir toksiski odu kāpuriem. Šo biotransformāciju daļēji pierādīja novērotā sēklu miltu larvicīdā aktivitāte un insekticīdās aktivitātes zudums, kad pundursinepju sēklu milti pirms lietošanas tika termiski apstrādāti. Paredzams, ka termiskā apstrāde iznīcinās hidrolītiskos enzīmus, kas aktivizē glikozinolātus, tādējādi novēršot bioaktīvo izotiocianātu veidošanos. Šis ir pirmais pētījums, kas apstiprina kāpostu sēklu pulvera insekticīdās īpašības pret odiem ūdens vidē.
No testētajiem sēklu pulveriem visbīstamākais bija ūdenskreses sēklu pulveris (Ls), kas izraisīja augstu Aedes albopictus mirstību. Aedes aegypti kāpuri tika apstrādāti nepārtraukti 24 stundas. Atlikušajiem trim sēklu pulveriem (PG, IG un DFP) bija lēnāka aktivitāte, un tie joprojām izraisīja ievērojamu mirstību pēc 72 stundu nepārtrauktas apstrādes. Tikai Ls sēklu milti saturēja ievērojamu daudzumu glikozinolātu, savukārt PG un DFP saturēja mirozināzi, bet IG saturēja glikozinolātu kā galveno glikozinolātu (1. tabula). Glikotropaeolīns tiek hidrolizēts par BITC, un sinalbīns tiek hidrolizēts par 4-HBITC61,62. Mūsu bioanalīzes rezultāti liecina, ka gan Ls sēklu milti, gan sintētiskais BITC ir ļoti toksiski odu kāpuriem. PG un DFP sēklu miltu galvenā sastāvdaļa ir mirozināzes glikozinolāts, kas tiek hidrolizēts par AITC. AITC ir efektīvs odu kāpuru iznīcināšanā ar LC50 vērtību 19,35 ppm. Salīdzinot ar AITC un BITC, 4-HBITC izotiocianāts ir vismazāk toksisks kāpuriem. Lai gan AITC ir mazāk toksisks nekā BITC, to LC50 vērtības ir zemākas nekā daudzām ēteriskajām eļļām, kas testētas uz odu kāpuriem32,73,74,75.
Mūsu krustziežu dzimtas augu sēklu pulveris, kas paredzēts lietošanai pret odu kāpuriem, satur vienu galveno glikozinolātu, kas, kā noteikts ar AŠH hromatogrāfiju (HPLC), veido vairāk nekā 98–99 % no kopējā glikozinolātu daudzuma. Tika konstatēts arī neliels citu glikozinolātu daudzums, taču to līmenis bija mazāks par 0,3 % no kopējā glikozinolātu daudzuma. Ūdenskreses (L. sativum) sēklu pulveris satur sekundāros glikozinolātus (sinigrīnu), taču to īpatsvars ir 1 % no kopējā glikozinolātu daudzuma, un to saturs joprojām ir nenozīmīgs (apmēram 0,4 mg/g sēklu pulvera). Lai gan PG un DFP satur vienu un to pašu galveno glikozinolātu (mirozīnu), to sēklu miltu larvicīdā aktivitāte ievērojami atšķiras to LC50 vērtību dēļ. Atšķiras toksicitāte pret miltrasu. Aedes aegypti kāpuru parādīšanās var būt saistīta ar mirozināzes aktivitātes vai stabilitātes atšķirībām starp abām sēklu barībām. Mirozināzes aktivitātei ir svarīga loma hidrolīzes produktu, piemēram, izotiocianātu, biopieejamībā Brassicaceae augos76. Iepriekšējie Pocock et al.77 un Wilkinson et al.78 ziņojumi ir parādījuši, ka mirozināzes aktivitātes un stabilitātes izmaiņas var būt saistītas arī ar ģenētiskiem un vides faktoriem.
Paredzamais bioaktīvā izotiocianāta saturs tika aprēķināts, pamatojoties uz katras sēklu miltu LC50 vērtībām pēc 24 un 72 stundām (5. tabula), lai salīdzinātu ar atbilstošajām ķīmiskajām vielām. Pēc 24 stundām sēklu miltos esošie izotiocianāti bija toksiskāki nekā tīrie savienojumi. LC50 vērtības, kas aprēķinātas, pamatojoties uz izotiocianāta sēklu apstrādes miljondaļām (ppm), bija zemākas nekā LC50 vērtības BITC, AITC un 4-HBITC apstrādes gadījumā. Mēs novērojām, ka kāpuri patērē sēklu miltu granulas (3.A attēls). Līdz ar to, kāpuri var saņemt koncentrētāku toksisko izotiocianātu iedarbību, uzņemot sēklu miltu granulas. Tas bija visizteiktākais IG un PG sēklu miltu apstrādes gadījumā pēc 24 stundu iedarbības, kur LC50 koncentrācijas bija attiecīgi par 75% un 72% zemākas nekā tīra AITC un 4-HBITC apstrādes gadījumā. Ls un DFP apstrādes bija toksiskākas nekā tīrs izotiocianāts, ar LC50 vērtībām attiecīgi par 24% un 41% zemākas. Kontroles grupā kāpuri veiksmīgi iekūņojās (3.B att.), savukārt lielākā daļa kāpuru sēklu miltu grupā iekūņojās, un kāpuru attīstība bija ievērojami aizkavējusies (3.B,D att.). Spodopteralitura grupā izotiocianāti ir saistīti ar augšanas aizturi un attīstības aizkavēšanos79.
Ae. Aedes aegypti odu kāpuri 24–72 stundas tika nepārtraukti pakļauti Brassica sēklu pulvera iedarbībai. (A) Miruši kāpuri ar sēklu miltu daļiņām mutes dobumā (apvilkti ar apli); (B) Kontroles apstrāde (dH20 bez pievienota sēklu milta) liecina, ka kāpuri aug normāli un sāk kūniņot pēc 72 stundām. (C, D) Ar sēklu miltiem apstrādātie kāpuri; sēklu milti uzrādīja attīstības atšķirības un nekūpringa.
Mēs neesam pētījuši izotiocianātu toksiskās iedarbības mehānismu uz odu kāpuriem. Tomēr iepriekšējie pētījumi ar sarkanajām ugunsskudrām (Solenopsis invicta) ir parādījuši, ka glutationa S-transferāzes (GST) un esterāzes (EST) inhibīcija ir galvenais izotiocianāta bioaktivitātes mehānisms, un AITC pat ar zemu aktivitāti var inhibēt arī GST aktivitāti. sarkanās importētās ugunsskudras zemās koncentrācijās. Deva ir 0,5 µg/ml80. Turpretī AITC inhibē acetilholīnesterāzi pieaugušām kukurūzas smecerniecēm (Sitophilus zeamais)81. Līdzīgi pētījumi jāveic, lai noskaidrotu izotiocianāta aktivitātes mehānismu odu kāpuriem.
Mēs izmantojam termiski inaktivētu DFP apstrādi, lai pamatotu priekšlikumu, ka augu glikozinolātu hidrolīze, veidojot reaktīvus izotiocianātus, kalpo kā mehānisms odu kāpuru kontrolei ar sinepju sēklu miltiem. DFP-HT sēklu milti nebija toksiski testētajās lietošanas devās. Lafarga et al. 82 ziņoja, ka glikozinolāti ir jutīgi pret sadalīšanos augstā temperatūrā. Paredzams, ka termiskā apstrāde denaturēs arī mirozināzes enzīmu sēklu miltos un novērsīs glikozinolātu hidrolīzi, veidojot reaktīvus izotiocianātus. To apstiprināja arī Okunade et al. 75, kas parādīja, ka mirozināze ir jutīga pret temperatūru, parādot, ka mirozināzes aktivitāte tika pilnībā inaktivēta, kad sinepju, melno sinepju un asinssakņu sēklas tika pakļautas temperatūrai virs 80° C. Šie mehānismi var izraisīt termiski apstrādātu DFP sēklu miltu insekticīdās aktivitātes zudumu.
Tādējādi sinepju sēklu milti un to trīs galvenie izotiocianāti ir toksiski odu kāpuriem. Ņemot vērā šīs atšķirības starp sēklu miltiem un ķīmisko apstrādi, sēklu miltu izmantošana varētu būt efektīva odu apkarošanas metode. Ir nepieciešams noteikt piemērotas formulas un efektīvas piegādes sistēmas, lai uzlabotu sēklu pulveru lietošanas efektivitāti un stabilitāti. Mūsu rezultāti liecina par sinepju sēklu miltu potenciālu kā alternatīvu sintētiskajiem pesticīdiem. Šī tehnoloģija varētu kļūt par inovatīvu instrumentu odu pārnēsātāju kontrolei. Tā kā odu kāpuri plaukst ūdens vidē un sēklu miltu glikozinolāti hidratācijas rezultātā fermentatīvi tiek pārveidoti par aktīviem izotiocianātiem, sinepju sēklu miltu izmantošana odu invadētā ūdenī piedāvā ievērojamu kontroles potenciālu. Lai gan izotiocianātu larvicīdā aktivitāte atšķiras (BITC > AITC > 4-HBITC), ir nepieciešami papildu pētījumi, lai noteiktu, vai sēklu miltu apvienošana ar vairākiem glikozinolātiem sinerģiski palielina toksicitāti. Šis ir pirmais pētījums, kas demonstrē attaukotu krustziežu sēklu miltu un trīs bioaktīvo izotiocianātu insekticīdo iedarbību uz odiem. Šī pētījuma rezultāti ir jauna pavērsiena punkts, parādot, ka attaukoti kāpostu sēklu milti, kas ir eļļas ieguves blakusprodukts no sēklām, varētu kalpot kā daudzsološs larvicīds līdzeklis odu apkarošanai. Šī informācija var palīdzēt tālāk atklāt augu biokontroles līdzekļus un attīstīt tos kā lētus, praktiskus un videi draudzīgus biopesticīdus.
Šim pētījumam ģenerētie datu kopumi un iegūtās analīzes ir pieejamas no atbilstošā autora pēc saprātīga pieprasījuma. Pētījuma beigās visi pētījumā izmantotie materiāli (kukaiņi un sēklu milti) tika iznīcināti.
Publicēšanas laiks: 2024. gada 29. jūlijs