Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu labākos rezultātus, iesakām izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stila vai JavaScript.
Dabas produktu atklāšana un lietderīga izmantošana var palīdzēt uzlabot cilvēku dzīvi. Augu augšanu kavējošas ķīmiskās vielas tiek plaši izmantotas kā herbicīdi nezāļu apkarošanai. Tā kā ir nepieciešams izmantot dažāda veida herbicīdus, ir jāidentificē savienojumi ar jauniem darbības mehānismiem. Šajā pētījumā mēs atklājām jaunu N-alkoksipirola savienojumu, kumamonamīdu, no Streptomyces werraensis MK493-CF1, un izveidojām pilnīgu sintēzes procesu. Veicot bioloģiskās aktivitātes testus, mēs atklājām, ka urs-monoamīnskābe ir urs-monoamīda sintētisks starpprodukts un potenciāls...augu augšanas inhibitorsTurklāt esam izstrādājuši dažādus urbenonskābes atvasinājumus, tostarp urbeniloksi atvasinājumu (UDA), kam piemīt augsta herbicīdā aktivitāte, negatīvi neietekmējot HeLa šūnu augšanu. Mēs arī atklājām, ka urmotonskābes atvasinājumi pārtrauc augu mikrotubulu darbību; turklāt KAND ietekmē aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi; šī daudzpusīgā iedarbība atšķiras no zināmo mikrotubulu inhibitoru iedarbības un liecina par jaunu ursonskābes darbības mehānismu, kas ir būtiska priekšrocība jaunu herbicīdu izstrādē.
Labvēlīgu dabas produktu un to atvasinājumu atklāšana un praktiska pielietošana ir līdzeklis cilvēku dzīves kvalitātes uzlabošanai. Mikroorganismu, augu un kukaiņu ražotie sekundārie metabolīti ir noveduši pie ievērojamiem sasniegumiem medicīnā un lauksaimniecībā. No dabas produktiem ir izstrādātas daudzas antibiotikas un zāles pret leikēmiju. Turklāt dažādi veidipesticīdiNo šiem dabiskajiem produktiem lauksaimniecībā iegūst fungicīdus un herbicīdus. Jo īpaši nezāļu apkarošanas herbicīdi ir svarīgi līdzekļi kultūraugu ražas palielināšanai mūsdienu lauksaimniecībā, un dažādi savienojumu veidi jau tiek izmantoti komerciāli. Vairāki šūnu procesi augos, piemēram, fotosintēze, aminoskābju metabolisms, šūnu sieniņu sintēze, mitozes regulēšana, fitohormonu signalizācija vai olbaltumvielu sintēze, tiek uzskatīti par tipiskiem herbicīdu mērķiem. Savienojumi, kas kavē mikrotubulu funkciju, ir izplatīta herbicīdu klase, kas ietekmē augu augšanu, ietekmējot mitotisko regulāciju2.
Mikrotubulas ir citoskeleta sastāvdaļas un ir plaši konservētas eikariotu šūnās. Tubulīna heterodimērs sastāv no α-tubulīna un β-tubulīna, veidojot lineārus mikrotubulu protofilamentus, un 13 protofilamenti veido cilindrisku struktūru. Mikrotubulām augu šūnās ir vairākas lomas, tostarp nosakot šūnas formu, šūnu dalīšanos un intracelulāro transportu3,4. Augu šūnas satur mikrotubulu zem starpfāžu plazmas membrānas, un tiek uzskatīts, ka šie tā sauktie kortikālie mikrotubuluļi kontrolē celulozes mikrofibrilu organizāciju, regulējot celulozes sintāzes kompleksus4,5. Sakņu epidermas šūnu kortikālie mikrotubuluļi, kas atrodas saknes gala straujās pagarināšanās zonā, atrodas sānos, un celulozes mikrošķiedras seko šiem mikrotubuluļiem un ierobežo šūnu paplašināšanās virzienu, tādējādi veicinot anizotropisku šūnu pagarināšanos. Tāpēc mikrotubulu funkcija ir cieši saistīta ar augu morfoloģiju. Aminoskābju aizvietojumi gēnos, kas kodē tubulīnu, izraisa kortikālo mikrotubulu masīvu šķiedras un kreisās vai labās puses augšanu Arabidopsis 6,7. Līdzīgi, mutācijas mikrotubulu saistītos proteīnos, kas regulē mikrotubulu dinamiku, var izraisīt arī sakņu augšanas traucējumus8,9,10,11,12,13. Turklāt apstrāde ar mikrotubulu darbību traucējošiem herbicīdiem, piemēram, disopiramīdu, kas pazīstams arī kā pretilahlors, izraisa arī kreisās puses slīpo sakņu augšanu14. Šie dati liecina, ka precīza mikrotubulu funkcijas regulēšana ir kritiski svarīga augu augšanas virziena noteikšanai.
Ir atklāti dažādi mikrotubulu inhibitoru veidi, un šīs zāles ir devušas nozīmīgu ieguldījumu citoskeleta pētījumos, kā arī lauksaimniecībā un medicīnā2. Jo īpaši orizalīns, dinitroanilīna savienojumi, disopiramīds, benzamīdam radniecīgi savienojumi un to analogi var kavēt mikrotubulu funkciju un tādējādi kavēt augu augšanu. Tāpēc tos plaši izmanto kā herbicīdus. Tomēr, tā kā mikrotubuluļi ir svarīga augu un dzīvnieku šūnu sastāvdaļa, lielākā daļa mikrotubulu inhibitoru ir citotoksiski abiem šūnu tipiem. Tāpēc, neskatoties uz to atzīto lietderību kā herbicīdiem, praktiskiem mērķiem tiek izmantots ierobežots skaits antimikrotubulu līdzekļu.
Streptomyces ir Streptomyces dzimtas ģints, kurā ietilpst aerobas, grampozitīvas, pavedienveida baktērijas, un tā ir plaši pazīstama ar savu spēju ražot plašu sekundāro metabolītu klāstu. Tāpēc tā tiek uzskatīta par vienu no svarīgākajiem jaunu bioloģiski aktīvu dabas produktu avotiem. Pašreizējā pētījumā mēs atklājām jaunu savienojumu, ko sauc par kumamonamīdu, kas tika izolēts no Streptomyces werraensis MK493-CF1 un S. werraensis ISP 5486. Izmantojot spektrālo analīzi un pilnu spektrālo analīzi, tika raksturota kumamonamīda struktūra un noteikts tā unikālais N-alkoksipirola skelets. Tika konstatēts, ka ursmonoskābe, ursmonoamīda un tā atvasinājumu sintētiskais starpprodukts, kavē populārā modeļa auga Arabidopsis thaliana augšanu un dīgšanu. Struktūras un aktivitātes attiecību pētījumā mēs atklājām, ka savienojums ar C9, kas modificēts uz ursonskābi, ko sauc par ursonskābes noniloksi atvasinājumu (KAND), ievērojami pastiprina inhibējošo ietekmi uz augšanu un dīgtspēju. Jāatzīmē, ka jaunatklātais augu augšanas inhibitors ietekmēja arī tabakas un aknu mises augšanu un nebija citotoksisks baktērijām vai HeLa šūnām. Turklāt daži urmotonskābes atvasinājumi izraisa izkropļotu sakņu fenotipu, kas nozīmē, ka šie atvasinājumi tieši vai netieši ietekmē mikrotubulus. Saskaņā ar šo ideju mūsu novērojumi par mikrotubuliem, kas iezīmēti vai nu imūnhistoķīmiski, vai ar fluorescējošiem proteīniem, liecina, ka KAND apstrāde depolimerizē mikrotubulus. Turklāt apstrāde ar kumamotonskābes atvasinājumiem pārtrauca aktīna mikrofilamentus. Tādējādi esam atklājuši jaunu augu augšanas inhibitoru, kura unikālais darbības mehānisms ietver citoskeleta iznīcināšanu.
Celms MK493-CF1 tika izolēts no augsnes Šinagavas rajonā, Tokijā. Celms MK493-CF1 veidoja labi sazarotu stromas micēliju. Tika noteikta 16S ribosomu RNS gēna daļēja secība (1422 bp). Šis celms ir ļoti līdzīgs S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipiskais celms, 99,93%). Pamatojoties uz šo rezultātu, tika noteikts, ka šis celms ir cieši saistīts ar S. werraensis tipa celmu. Tāpēc mēs provizoriski nosaucām šo celmu par S. werraensis MK493-CF1. Arī S. werraensis ISP 5486T ražo tos pašus bioaktīvos savienojumus. Tā kā sākotnēji bija maz pētījumu par dabisko produktu iegūšanu no šī mikroorganisma, tika veikti turpmāki ķīmiskie pētījumi. Pēc S. werraensis MK493-CF1 kultivēšanas miežu barotnē, izmantojot cietfāzes fermentāciju 30°C temperatūrā 14 dienas, barotne tika ekstrahēta ar 50% EtOH. 60 ml parauga tika žāvēti, iegūstot 59,5 mg neattīrīta ekstrakta. Neattīrītais ekstrakts tika apstrādāts ar apgrieztās fāzes HPLC, iegūstot N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamīdu (1, nosaukts par kumamonamīdu, 36,0 mg). Kopējais 1 daudzums ir aptuveni 60% no neattīrīta ekstrakta. Tāpēc mēs nolēmām detalizēti izpētīt kumamotoamīda 1 īpašības.
Kumamonamīds 1 ir balts amorfs pulveris, un augstas izšķirtspējas masas spektrometrija (HRESIMS) apstiprina C6H8N2O2 klātbūtni (1. att.). Šī savienojuma C2-aizvietotajam pirola fragmentam raksturīgs δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H NMR spektrā: 4,5 Hz, H-5) un δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), un 13C NMR spektrs parāda četru sp2 oglekļa atomu klātbūtni. Amīda grupas klātbūtne C2 pozīcijā tika novērtēta ar HMBC korelāciju no C-3 protona līdz amīda karbonilogleklim pie δC 161,1. Turklāt 1H un 13C NMR pīķi pie δH 4,10 (3H, S) un δC 68,3 norāda uz N-metoksigrupu klātbūtni molekulā. Lai gan metoksigrupas pareizā pozīcija vēl nebija noteikta, izmantojot spektroskopisko analīzi, piemēram, pastiprināto diferenciālo spektroskopiju un kodolu Overhauzera saīsinājumu (NOEDF), N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamīds kļuva par pirmo kandidātu savienojumu.
Lai noteiktu pareizo 1. struktūras struktūru, tika veikta pilnīga sintēze (2.a att.). Komerciāli pieejamā 2-aminopiridīna 2 apstrāde ar m-CPBA kvantitatīvā daudzumā deva atbilstošo N-oksīdu 3. Pēc 2. savienojuma 2-aminoazidēšanas Abramoviča aprakstītā ciklokondensācijas reakcija tika veikta benzolā 90°C temperatūrā, lai iegūtu vēlamo 1-hidroksi-1H-pirol-2-karbonitrilu 5 gramos. Ātrums 60% (divi posmi). 15,16. Pēc tam 4. savienojuma metilēšana un hidrolīze deva 1-metoksi-1H-pirol-2-karbonskābi (sauktu par "kumotonskābi", 6) ar labu iznākumu (70%, divi posmi). Visbeidzot, amidēšana caur skābes hlorīda starpproduktu 6, izmantojot amonjaka ūdens šķīdumu, deva Kumamoto amīdu 1 ar 98% iznākumu. Visi sintezētā 1. savienojuma spektrālie dati bija līdzīgi izolētajam 1., tāpēc 1. savienojuma struktūra tika noteikta;
Urbenamīda un urbēnskābes bioloģiskās aktivitātes vispārīgā sintēze un analīze. (a) Kumamoto amīda pilnīga sintēze. (b) Septiņas dienas veci savvaļas tipa Arabidopsis Columbia (Col) stādi tika audzēti uz Murashige un Skoog (MS) plāksnēm, kas saturēja kumamonamīdu 6 vai kumamonamīdu 1 norādītajās koncentrācijās. Mēroga josla = 1 cm.
Vispirms mēs novērtējām urbenamīda un tā starpproduktu bioloģisko aktivitāti attiecībā uz to spēju modulēt augu augšanu. MS agara barotnei pievienojām dažādas ursmonamīda 1 vai ursmonskābes 6 koncentrācijas un uz šīs barotnes kultivējām Arabidopsis thaliana stādus. Šie testi parādīja, ka augsta 6 koncentrācija (500 μM) kavē sakņu augšanu (2.b att.). Pēc tam mēs ģenerējām dažādus atvasinājumus, aizvietojot 6 N1 pozīciju, un veicām ar tiem struktūras un aktivitātes attiecību pētījumus (analogās sintēzes process ir aprakstīts papildinformācijā (SI)). Arabidopsis stādi tika audzēti barotnē, kas saturēja 50 μM ursonskābes atvasinājumus, un tika mērīts sakņu garums, kā parādīts attēlā. Kā parādīts 3.a, b un S1 attēlā, kumamo skābēm ir dažāda garuma lineāras alkoksīda ķēdes (9, 10, 11, 12 un 13) vai lielas alkoksīda ķēdes (15, 16 un 17) N1 pozīcijā. Atvasinājumi uzrādīja ievērojamu sakņu augšanas inhibīciju. Turklāt mēs atklājām, ka 200 μM 10, 11 vai 17 lietošana kavēja dīgtspēju (3.c un S2 att.).
Kumamoto amīda un radniecīgo savienojumu struktūras un aktivitātes attiecību pētījums. (a) Analogu struktūra un sintēzes shēma. (b) 7 dienas vecu stādu, kas audzēti MS vidē ar vai bez 50 μM kumamonamīda atvasinājumiem, sakņu garuma kvantitatīva noteikšana. Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar placebo apstrādi (t tests, p< 0,05). n>18. Dati ir parādīti kā vidējais ± SD. nt nozīmē “nav testēts”, jo vairāk nekā 50% sēklu neuzdīga. (c) Apstrādātu sēklu, kas 7 dienas inkubētas MS vidē ar vai bez 200 μM kumonamonamīda un radniecīgiem savienojumiem, dīgtspējas kvantitatīva noteikšana. Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar placebo apstrādi (hi kvadrāta tests). n=96.
Interesanti, ka alkil sānu ķēžu, kas garākas par C9, pievienošana samazināja inhibējošo aktivitāti, kas liecina, ka ar kumamotoīnskābi saistītiem savienojumiem ir nepieciešamas noteikta izmēra sānu ķēdes, lai parādītu to bioloģisko aktivitāti.
Tā kā struktūras un aktivitātes attiecību analīze parādīja, ka C9 tika modificēts par ursonskābi un ursonskābes noniloksi atvasinājums (turpmāk tekstā KAND 11) bija visefektīvākais augu augšanas inhibitors, mēs veicām detalizētāku KAND 11 raksturojumu. Arabidopsis apstrāde ar 50 μM KAND 11 gandrīz pilnībā novērsa dīgšanu, savukārt zemākas KAND 11 koncentrācijas (40, 30, 20 vai 10 μM) kavēja sakņu augšanu no devas atkarīgā veidā (4.a, b att.). Lai pārbaudītu, vai KAND 11 ietekmē sakņu meristēmu dzīvotspēju, mēs pārbaudījām sakņu meristēmas, kas iekrāsotas ar propīdija jodīdu (PI), un izmērījām meristēmu laukuma lielumu. Stādu, kas audzēti uz barotnes, kas satur 25 μM KAND-11, meristēma izmērs bija 151,1 ± 32,5 μm, savukārt stādu, kas audzēti uz kontroles barotnes, kas satur DMSO, meristēma izmērs bija 264,7 ± 30,8 μm (4.c, d att.), kas norāda, ka KAND-11 atjauno šūnu aktivitāti. Sakņu meristēma. Saskaņā ar to KAND 11 apstrāde samazināja šūnu dalīšanās marķiera CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signāla daudzumu sakņu meristēmā (4.e att.) 17. Šie rezultāti liecina, ka KAND 11 kavē sakņu augšanu, samazinot šūnu proliferācijas aktivitāti.
Urbenonskābes atvasinājumu (urbeniloksi atvasinājumu) inhibējošās ietekmes uz augšanu analīze. (a) 7 dienas veci savvaļas tipa Col stādi, kas audzēti uz MS plāksnēm ar norādītajām KAND 11 koncentrācijām. Mēroga josla = 1 cm. (b) Sakņu garuma kvantitatīva noteikšana. Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, p< 0,05). n>16. Dati ir parādīti kā vidējais ± SD. (c) Propīdija jodīda iekrāsotu savvaļas tipa Col sakņu konfokālā mikroskopija, kas audzēta MS plāksnēs ar vai bez 25 μM KAND 11. Baltās iekavas norāda saknes meristēmu. Mēroga josla = 100 µm. (d) Saknes meristēmas izmēra kvantitatīva noteikšana (n = 10 līdz 11). Statistiskās atšķirības tika noteiktas, izmantojot t-testu (p< 0,05). Stieņi attēlo vidējo meristēmas izmēru. (e) Saknes meristēmas, kas satur CDKB2 konstrukciju, diferenciālās interferences kontrasta (DIC) mikroskopija; 1pro: CDKB2; 1-GUS iekrāsots un iekrāsots uz 5 dienas veciem stādiem, kas audzēti MS plāksnēs ar vai bez 25 µM KAND testa.
KAND 11 fitotoksicitāte tika tālāk pārbaudīta, izmantojot citu divdīgļlapju augu, tabaku (Nicotiana tabacum), un galveno sauszemes augu modeļa organismu, aknu misti (Marchantia polymorpha). Tāpat kā Arabidopsis gadījumā, tabakas SR-1 stādi, kas audzēti uz barotnes, kas satur 25 μM KAND 11, veidoja īsākas saknes (5.a att.). Turklāt 40 no 48 sēklām uzdīga uz plāksnēm, kas satur 200 μM KAND 11, savukārt visas 48 sēklas uzdīga uz mākslīgi apstrādātas barotnes, kas norāda, ka augstākas KAND koncentrācijas bija nozīmīgas (p< 0,05; hi tests - kvadrāts) kavēja tabakas dīgšanu. (5.b att.). Turklāt KAND 11 koncentrācija, kas kavēja baktēriju augšanu aknu misē, bija līdzīga efektīvajai koncentrācijai Arabidopsis (5.c att.). Šie rezultāti liecina, ka KAND 11 var kavēt dažādu augu augšanu. Pēc tam mēs pētījām lāču monoamīdu radniecīgo savienojumu iespējamo citotoksicitāti citos organismos, proti, cilvēka HeLa šūnās un Escherichia coli celmā DH5α, kas attiecīgi pārstāv augstāko dzīvnieku un baktēriju šūnas. Virknē šūnu proliferācijas testu mēs novērojām, ka kumamonamīds 1, kumamonamīdskābe 6 un KAND 11 neietekmēja HeLa vai E. coli šūnu augšanu 100 μM koncentrācijās (5.d,e att.).
KAND 11 augšanas inhibīcija organismos, kas nepieder pie Arabidopsis. (a) Divas nedēļas veci savvaļas tipa SR-1 tabakas stādi tika audzēti uz vertikāli novietotām MS plāksnēm, kas saturēja 25 μM KAND 11. (b) Divas nedēļas veci savvaļas tipa SR-1 tabakas stādi tika audzēti uz horizontāli novietotām MS plāksnēm, kas saturēja 200 μM KAND 11. (c) Divas nedēļas veci savvaļas tipa Tak-1 aknu mistes pumpuri, kas audzēti uz Gamborg B5 plāksnēm ar norādītajām KAND 11 koncentrācijām. Sarkanās bultiņas norāda sporas, kas pārstāja augt divu nedēļu inkubācijas periodā. (d) HeLa šūnu proliferācijas tests. Dzīvotspējīgo šūnu skaits tika mērīts fiksētos laika intervālos, izmantojot šūnu skaitīšanas komplektu 8 (Dojindo). Kā kontrole HeLa šūnas tika apstrādātas ar 5 μg/ml aktinomicīna D (Act D), kas inhibē RNS polimerāzes transkripciju un izraisa šūnu nāvi. Analīzes tika veiktas trīs reizes. (e) E. coli šūnu proliferācijas tests. E. coli augšana tika analizēta, mērot OD600. Kontroles nolūkā šūnas tika apstrādātas ar 50 μg/ml ampicilīna (Amp), kas kavē baktēriju šūnu sieniņu sintēzi. Analīzes tika veiktas trīs reizes.
Lai atšifrētu uramīda savienojumu izraisītās citotoksicitātes darbības mehānismu, mēs atkārtoti analizējām urbēnskābes atvasinājumus ar mērenu inhibējošu iedarbību, kā parādīts attēlā. Kā parādīts 2.b, 6.a attēlā, stādi, kas audzēti uz agara plāksnēm, kas satur augstu urmotonskābes 6 koncentrāciju (200 μM), veidoja īsākas un pa kreisi izliektas saknes (θ = –23,7 ± 6,1), savukārt stādiem, kas audzēti kontroles vidē, veidoja gandrīz taisnas saknes (θ = –3,8 ± 7,1). Ir zināms, ka šī raksturīgā slīpā augšana rodas kortikālo mikrotubulu disfunkcijas rezultātā14,18. Saskaņā ar šo atklājumu mikrotubulu destabilizējošās zāles disopiramīds un orizalīns mūsu augšanas apstākļos izraisīja līdzīgu sakņu sasvēršanos (2.b, 6.a att.). Tajā pašā laikā mēs testējām urmotonskābes atvasinājumus un atlasījām vairākus no tiem, kas noteiktās koncentrācijās izraisīja slīpu sakņu augšanu. Savienojumi 8, 9 un 15 mainīja sakņu augšanas virzienu attiecīgi pie 75 μM, 50 μM un 40 μM, norādot, ka šie savienojumi var efektīvi destabilizēt mikrotubulu (2.b, 6.a att.). Mēs arī testējām visspēcīgāko ursolskābes atvasinājumu KAND 11 zemākā koncentrācijā (15 µM) un atklājām, ka KAND 11 lietošana kavē sakņu augšanu un ka sakņu augšanas virziens ir nevienmērīgs, lai gan tām ir tendence slīpt pa kreisi (C3. attēls). Tā kā lielākas mikrotubulu destabilizējošo zāļu koncentrācijas dažreiz kavē augu augšanu, nevis izraisa sakņu sasvēršanos, mēs pēc tam novērtējām iespēju, ka KAND 11 ietekmē mikrotubulu, novērojot kortikālos mikrotubulu sakņu epidermas šūnās. Imunohistoķīmija, izmantojot anti-β-tubulīna antivielas stādu sakņu epidermas šūnās, kas apstrādātas ar 25 μM KAND 11, parādīja gandrīz visu kortikālo mikrotubulu izzušanu epidermas šūnās pagarinājuma zonā (6.b att.). Šie rezultāti liecina, ka kumamotonskābe un tās atvasinājumi tieši vai netieši iedarbojas uz mikrotubuliem, tos traucējot, un ka šie savienojumi ir jauni mikrotubulu inhibitori.
Ursonskābe un tās atvasinājumi maina Arabidopsis thaliana kortikālos mikrotubulu. (a) Sakņu slīpuma leņķis, kas mērīts dažādu urmotonskābes atvasinājumu klātbūtnē norādītajās koncentrācijās. Tika analizēta arī divu savienojumu, kas zināmi kā mikrotubulu inhibētāji, - dizopiramīda un orizalīna - ietekme. Ieliktnī parādīts standarts, ko izmanto sakņu augšanas leņķa mērīšanai. Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar placebo apstrādi (t tests, p< 0,05). n>19. Mēroga josla = 1 cm. (b) Kortikālās mikrotubulu šūnas epidermas šūnās elongācijas zonā. Savvaļas tipa Arabidopsis Col sakņu mikrotubulu vizualizācija tika veikta ar imūnhistoķīmisku krāsošanu, izmantojot β-tubulīna primārās antivielas un Alexa Fluor konjugētas sekundārās antivielas. Mēroga josla = 10 µm. (c) Mikrotubulu mitotiskā struktūra sakņu meristēmā. Mikrotubulu vizualizācija tika veikta, izmantojot imūnhistoķīmisku krāsošanu. Mitotiskās struktūras, tostarp profāzes zonas, vārpstiņas un fragmoplasti, tika skaitītas no konfokālajiem attēliem. Bultiņas norāda mitotisko mikrotubulu struktūras. Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar placebo terapiju (t tests, p< 0,05). n>9. Mēroga josla = 50 µm.
Lai gan Ursa spēj traucēt mikrotubulu funkciju, paredzams, ka tā darbības mehānisms atšķirsies no tipiskiem mikrotubulu depolimerizācijas līdzekļiem. Piemēram, augstākas mikrotubulu depolimerizācijas līdzekļu, piemēram, disopiramīda un orizalīna, koncentrācijas izraisa epidermas šūnu anizotropisku paplašināšanos, savukārt KAND 11 to nedara. Turklāt KAND 11 un disopiramīda vienlaicīga lietošana izraisīja kombinētu disopiramīda izraisītu sakņu augšanas reakciju, un tika novērota KAND 11 izraisīta augšanas inhibīcija (S4. att.). Mēs analizējām arī paaugstinātas jutības disopiramīda 1-1 (phs1-1) mutanta reakciju uz KAND 11. phs1-1 ir nekanoniska tubulīna kināzes punkta mutācija, un, apstrādājot ar disopiramīdu, tas veido īsākas saknes9,20. phs1-1 mutantu stādiem, kas audzēti uz agara barotnes, kas satur KAND 11, bija īsākas saknes, līdzīgas tām, kas audzētas uz disopiramīda (S5. att.).
Turklāt ar KAND 11 apstrādātu stādu sakņu meristēmā mēs novērojām mitotisku mikrotubulu struktūras, piemēram, profāzes zonas, vārpstas un fragmoplastus. Saskaņā ar novērojumiem par CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS tika novērota ievērojama mitotisko mikrotubulu skaita samazināšanās (6.c att.).
Lai raksturotu KAND 11 citotoksicitāti subcelulārā izšķirtspējā, mēs apstrādājām tabakas BY-2 suspensijas šūnas ar KAND 11 un novērojām to reakciju. Vispirms mēs pievienojām KAND 11 BY-2 šūnām, kas ekspresē TagRFP-TUA6, kas fluorescējoši iezīmē mikrotubulu, lai novērtētu KAND 11 ietekmi uz kortikālajiem mikrotubuluļiem. Kortikālo mikrotubulu blīvums tika novērtēts, izmantojot attēlu analīzi, kas kvantitatīvi noteica citoskeleta pikseļu procentuālo daudzumu citoplazmas pikseļos. Testa rezultāti parādīja, ka pēc apstrādes ar 50 μM vai 100 μM KAND 11 1 stundu, blīvums ievērojami samazinājās līdz attiecīgi 0,94 ± 0,74% vai 0,23 ± 0,28%, savukārt ar DMSO apstrādāto šūnu blīvums sasniedza 1,61 ± 0,34% (7.a att.). Šie rezultāti saskan ar novērojumu Arabidopsis, ka apstrāde ar KAND 11 izraisa kortikālo mikrotubulu depolimerizāciju (6.b att.). Mēs arī pārbaudījām BY-2 līniju ar GFP-ABD iezīmētiem aktīna pavedieniem pēc apstrādes ar tādu pašu KAND 11 koncentrāciju un novērojām, ka KAND 11 apstrāde pārtrauca aktīna pavedienus. Apstrāde ar 50 μM vai 100 μM KAND 11 1 stundu ievērojami samazināja aktīna pavedienu blīvumu attiecīgi līdz 1,20 ± 0,62% vai 0,61 ± 0,26%, savukārt blīvums DMSO apstrādātajās šūnās bija 1,69 ± 0,51% (2. att.). 7b). Šie rezultāti ir pretrunā ar propizamīda, kas neietekmē aktīna pavedienus, un latrunkulīna B, aktīna depolimerizatora, kas neietekmē mikrotubulas, iedarbību (SI S6. attēls). Turklāt apstrāde ar kumamonamīdu 1, kumamonamīdskābi 6 vai KAND 11 neietekmēja mikrotubulas HeLa šūnās (SI S7. attēls). Tādējādi tiek uzskatīts, ka KAND 11 darbības mehānisms atšķiras no zināmo citoskeleta traucētāju darbības mehānisma. Turklāt mūsu mikroskopiskais BY-2 šūnu, kas apstrādātas ar KAND 11, novērojums atklāja šūnu nāves sākšanos KAND 11 apstrādes laikā un parādīja, ka Evansa zilā krāsā iekrāsoto mirušo šūnu īpatsvars pēc 30 minūšu KAND 11 apstrādes būtiski nepalielinājās, savukārt pēc 90 minūšu apstrādes ar 50 μM vai 100 μM KAND mirušo šūnu skaits palielinājās attiecīgi līdz 43,7% vai 80,1% (7.c attēls). Kopumā šie dati liecina, ka jaunais ursolskābes atvasinājums KAND 11 ir augiem specifisks citoskeleta inhibitors ar iepriekš nezināmu darbības mehānismu.
KAND ietekmē kortikālos mikrotubulu, aktīna pavedienus un tabakas BY-2 šūnu dzīvotspēju. (a) Kortikālo mikrotubulu vizualizācija BY-2 šūnās TagRFP-TUA6 klātbūtnē. Ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO apstrādātās BY-2 šūnas tika pārbaudītas ar konfokālo mikroskopiju. Kortikālā mikrotubulu blīvums tika aprēķināts no 25 neatkarīgu šūnu mikroattēliem. Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, p< 0,05). Mēroga josla = 10 µm. (b) Kortikālā aktīna pavedieni BY-2 šūnās, vizualizēti GFP-ABD2 klātbūtnē. Ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO apstrādātās BY-2 šūnas tika pārbaudītas ar konfokālo mikroskopiju. Kortikālā aktīna pavedienu blīvums tika aprēķināts no 25 neatkarīgu šūnu mikroattēliem. Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, p< 0,05). Mēroga josla = 10 µm. (c) Mirušo BY-2 šūnu novērošana, izmantojot Evansa zilo krāsošanu. Ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO apstrādātās BY-2 šūnas tika pārbaudītas ar spilgtā lauka mikroskopiju. n=3. Mēroga josla = 100 µm.
Jaunu dabas produktu atklāšana un pielietošana ir novedusi pie ievērojamiem sasniegumiem dažādos cilvēka dzīves aspektos, tostarp medicīnā un lauksaimniecībā. Ir veikti vēsturiski pētījumi, lai iegūtu noderīgus savienojumus no dabas resursiem. Jo īpaši ir zināms, ka aktinomicētes ir noderīgas kā pretparazitāra antibiotikas nematodēm, pateicoties to spējai ražot dažādus sekundārus metabolītus, piemēram, avermektīnu, ivermektīna galveno savienojumu, un bleomicīnu un tā atvasinājumus, ko medicīnā izmanto kā pretvēža līdzekli21,22. Tāpat no aktinomicētēm ir atklāti dažādi herbicīdi savienojumi, no kuriem daži jau tiek izmantoti komerciāli1,23. Tāpēc aktinomicētu metabolītu analīze, lai izolētu dabiskos produktus ar vēlamo bioloģisko aktivitāti, tiek uzskatīta par efektīvu stratēģiju. Šajā pētījumā mēs atklājām jaunu savienojumu - kumamonamīdu - no S. werraensis un veiksmīgi to sintezējām. Ursonskābe ir sintētisks urbenamīda un tā atvasinājumu starpprodukts. Tā var izraisīt raksturīgu sakņu čokurošanos, uzrādīt mērenu vai spēcīgu herbicīdu aktivitāti un tieši vai netieši bojāt augu mikrotubulu. Tomēr urmotonskābes darbības mehānisms var atšķirties no esošo mikrotubulu inhibitoru darbības mehānisma, jo KAND 11 arī pārtrauc aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi, kas liecina par regulējošu mehānismu, ar kuru urmotonskābe un tās atvasinājumi ietekmē plašu citoskeleta struktūru klāstu.
Sīkāka urbenonskābes raksturošana palīdzēs labāk izprast urbenonskābes darbības mehānismu. Konkrēti, nākamais mērķis ir novērtēt ursonskābes spēju saistīties ar reducētiem mikrotubuliem, lai noteiktu, vai ursonskābe un tās atvasinājumi iedarbojas tieši uz mikrotubuliem un depolimerizē tos, vai arī to darbība izraisa mikrotubulu destabilizāciju. Turklāt, ja mikrotubuli nav tiešs mērķis, ursonskābes darbības vietas un molekulāro mērķu identificēšana uz augu šūnām palīdzēs labāk izprast radniecīgo savienojumu īpašības un iespējamos veidus, kā uzlabot herbicīdo aktivitāti. Mūsu bioaktivitātes tests atklāja ursonskābes unikālo citotoksisko spēju uz tādu augu kā Arabidopsis thaliana, tabakas un aknu mises augšanu, savukārt ne E. coli, ne HeLa šūnas netika ietekmētas. Neliela vai nekāda toksicitāte dzīvnieku šūnām ir ursonskābes atvasinājumu priekšrocība, ja tie tiek izstrādāti kā herbicīdi lietošanai atklātos lauksaimniecības laukos. Patiešām, tā kā mikrotubuli ir izplatītas struktūras eikariotos, to selektīvā inhibīcija augos ir galvenā prasība herbicīdiem. Piemēram, propizamīds, mikrotubulu depolimerizējošs līdzeklis, kas tieši saistās ar tubulīnu un kavē polimerizāciju, tiek izmantots kā herbicīds, jo tam ir zema toksicitāte dzīvnieku šūnām24. Atšķirībā no disopiramīda, radniecīgajiem benzamīdiem ir atšķirīga mērķa specifika. Papildus augu mikrotubuļiem RH-4032 jeb benzoksamīds kavē arī dzīvnieku šūnu vai oomicētu mikrotubuļus, un zalilamīds tiek izmantots kā fungicīds, jo tam ir zema fitotoksicitāte25,26,27. Jaunatklātais lācis un tā atvasinājumi uzrāda selektīvu citotoksicitāti pret augiem, taču ir vērts atzīmēt, ka turpmākas modifikācijas var mainīt to mērķa specifiku, potenciāli nodrošinot papildu atvasinājumus patogēno sēnīšu vai oomicētu kontrolei.
Urbenonskābes un tās atvasinājumu unikālās īpašības ir noderīgas to izstrādei kā herbicīdiem un izmantošanai kā pētniecības instrumentiem. Citoskeleta nozīme augu šūnu formas kontrolē ir plaši atzīta. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka augi ir attīstījuši sarežģītus kortikālo mikrotubulu organizācijas mehānismus, kontrolējot mikrotubulu dinamiku, lai pareizi kontrolētu morfoģenēzi. Ir identificēts liels skaits molekulu, kas ir atbildīgas par mikrotubulu aktivitātes regulēšanu, un saistītie pētījumi joprojām turpinās3,4,28. Mūsu pašreizējā izpratne par mikrotubulu dinamiku augu šūnās pilnībā neizskaidro kortikālo mikrotubulu organizācijas mehānismus. Piemēram, lai gan gan dizopiramīds, gan orizalīns var depolimerizēt mikrotubulu, dizopiramīds izraisa smagu sakņu deformāciju, savukārt orizalīnam ir relatīvi viegla ietekme. Turklāt tubulīna mutācijas, kas stabilizē mikrotubulu, izraisa arī sakņu dekstrorotāciju, savukārt paklitaksels, kas arī stabilizē mikrotubulu dinamiku, to nedara. Tāpēc ursolskābes molekulāro mērķu izpēte un identificēšana sniegtu jaunu ieskatu augu kortikālo mikrotubulu regulācijā. Tāpat turpmāki ķīmisko vielu, kas efektīvi veicina izkropļotu augšanu, piemēram, disopiramīda, un mazāk efektīvu ķīmisko vielu, piemēram, orizalīna vai kumamotorskābes, salīdzinājumi sniegs norādes par to, kā notiek izkropļota augšana.
No otras puses, ar aizsardzību saistītas citoskeleta pārkārtošanās ir vēl viena iespēja izskaidrot ursonskābes citotoksicitāti. Patogēna inficēšana vai elicitora ievadīšana augu šūnās dažreiz izraisa citoskeleta iznīcināšanu un sekojošu šūnu nāvi29. Piemēram, ir ziņots, ka no oomicētēm iegūts kriptoksantīns pirms tabakas šūnu nāves iznīcina mikrotubulu un aktīna pavedienus, līdzīgi tam, kas notiek ar KAND apstrādi30,31. Līdzības starp aizsardzības reakcijām un ursonskābes izraisītajām šūnu reakcijām lika mums izvirzīt hipotēzi, ka tās izraisa kopīgus šūnu procesus, lai gan ir acīmredzama ātrāka un spēcīgāka ursonskābes iedarbība nekā kriptoksantīnam. Tomēr pētījumi ir parādījuši, ka aktīna pavedienu iznīcināšana veicina spontānu šūnu nāvi, ko ne vienmēr pavada mikrotubulu bojāeja29. Turklāt vēl jānoskaidro, vai patogēns vai elicitors izraisa sakņu augšanas traucējumus, kā to dara ursonskābes atvasinājumi. Tādējādi molekulārās zināšanas, kas saista aizsardzības reakcijas un citoskeletu, ir pievilcīga problēma, kas jārisina. Izmantojot ursonskābes radniecīgu zemas molekulmasas savienojumu klātbūtni, kā arī virkni atvasinājumu ar dažādu iedarbību, tie var sniegt iespējas vērsties pret nezināmiem šūnu mehānismiem.
Kopumā jaunu savienojumu, kas modulē mikrotubulu dinamiku, atklāšana un pielietošana nodrošinās spēcīgas metodes, lai risinātu sarežģītos molekulāros mehānismus, kas ir augu šūnu formas noteikšanas pamatā. Šajā kontekstā nesen izstrādātais savienojums urmotonskābe, kas ietekmē mikrotubulu un aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi, varētu sniegt iespēju atšifrēt saistību starp mikrotubulu kontroli un šiem citiem mehānismiem. Tādējādi ķīmiskā un bioloģiskā analīze, izmantojot urbenonskābi, palīdzēs mums izprast molekulāros regulēšanas mehānismus, kas kontrolē augu citoskeletu.
S. werraensis MK493-CF1 inokulēt 500 ml Erlenmeijera kolbā ar deflektoru, kas satur 110 ml sēklas barotnes, kas sastāv no 2% (s/v) galaktozes, 2% (s/v) Essence pastas, 1% (s/v) Bacto kompozīcijas. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (s/v) kukurūzas ekstrakta (KOGOSTCH Co., Ltd., Japāna), 0,2% (s/v) (NH4)2SO4 un 0,2% CaCO3 dejonizētā ūdenī. (pH 7,4 pirms sterilizācijas). Sēklas kultūras tika inkubētas rotācijas kratītājā (180 apgr./min) 27°C temperatūrā 2 dienas. Produktīva kultivēšana, izmantojot cietfāzes fermentāciju. Sēklas kultūra (7 ml) tika pārvietota 500 ml K-1 kolbā, kas saturēja 40 g ražošanas barotnes, kas sastāvēja no 15 g presētu miežu (MUSO Co., Ltd., Japāna) un 25 g dejonizēta ūdens (pH pirms sterilizācijas netika koriģēts). Fermentācija tika veikta 30°C temperatūrā tumsā 14 dienas. Fermentācijas materiāls tika ekstrahēts ar 40 ml/pudele EtOH un centrifugēts (1500 g, 4°C, 10 min). Kultūras supernatants (60 ml) tika ekstrahēts ar 10% MeOH/EtOAc maisījumu. Organisko slāni iztvaicēja pazeminātā spiedienā, iegūstot atlikumu (59,5 mg), kas tika pakļauts HPLC ar gradienta eluēšanu (0–10 minūtes: 90%) apgrieztās fāzes kolonnā (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × garums 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minūtes: 90% H2O/CH3CN līdz 70% H2O/CH3CN (gradients), 35–45 minūtes: 90% H2O/EtOH, 45–155 minūtes: 90% H2O/EtOH līdz 100% EtOH (gradients (gradients), 155–200 min: 100% EtOH) ar plūsmas ātrumu 1,5 ml/min, kumamonamīds (1, 36,0 mg) tika izolēts kā balts amorfs pulveris.
Kumamotoamīds(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ aprēķinātā vērtība: 141,0659, izmērītā vērtība: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Kolumbijas sēklas (Col-0) tika iegūtas no Arabidopsis Bioloģisko resursu centra (ABRC) ar atļauju izmantošanai pētniecībā. Col-0 sēklas tika pavairotas un turētas mūsu laboratorijas apstākļos un izmantotas kā savvaļas tipa Arabidopsis augi. Arabidopsis sēklas tika sterilizētas pa virspusēji un kultivētas puskoncentrācijas Murashige un Skoog vidē, kas satur 2% saharozes (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etānsulfonskābes (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) un 1,5% agara (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C temperatūrā un pastāvīgā apgaismojumā. phs1-1 mutanta sēklas nodrošināja T. Hašimoto (Nara Zinātnes un tehnoloģijas institūts).
SR-1 celma sēklas nodrošināja T. Hašimoto (Nara Zinātnes un tehnoloģiju institūts), un tās tika izmantotas kā savvaļas tipa tabakas augi. Tabakas sēklas tika sterilizētas virspusē un trīs naktis iemērcētas sterilā ūdenī, lai veicinātu dīgšanu, pēc tam ievietotas puskoncentrācijas šķīdumā, kas satur 2% saharozes, 0,05% (w/v) MES un 0,8% gellāna sveķu (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige un Skoog barotne) ar pH 5,7, un inkubētas 23°C temperatūrā pastāvīgā apgaismojumā.
Celmu Tak-1 nodrošināja T. Kohči (Kioto Universitāte), un tas tika izmantots kā standarta eksperimentālā vienība aknu sēnītes pētījumā. Gemmu ieguva no sterilizētiem kultivētiem augiem un pēc tam uzklāja uz Gamborg B5 barotnes (Fujifilm Wako Pure Chemical), kas saturēja 1% saharozes un 0,3% gellāna sveķu, un inkubēja 23°C temperatūrā nepārtrauktā apgaismojumā.
Tabakas BY-2 šūnas (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) nodrošināja S. Hasezava (Tokijas Universitāte). BY-2 šūnas tika atšķaidītas 95 reizes modificētā Linsmeiera un Skoog vidē un katru nedēļu papildinātas ar 2,4-dihlorfenoksietiķskābi 32. Šūnu suspensiju maisīja rotācijas kratītājā ar ātrumu 130 apgr./min 27°C temperatūrā tumsā. Šūnas mazgāja ar 10 reizes lielāku svaigas barotnes tilpumu un atkārtoti suspendēja tajā pašā vidē. BY-2 transgēnās šūnu līnijas, kas stabili ekspresē mikrotubulu marķieri TagRFP-TUA6 vai aktīna pavedienu marķieri GFP-ABD2 zem ziedkāpostu mozaīkas vīrusa 35S promotera, tika ģenerētas, kā aprakstīts 33,34,35. Šīs šūnu līnijas var uzturēt un sinhronizēt, izmantojot procedūras, kas līdzīgas tām, kas tika izmantotas sākotnējai BY-2 šūnu līnijai.
HeLa šūnas tika kultivētas Dulbeko modificētajā Īgla vidē (DMEM) (Life Technologies), kas papildināta ar 10% liellopu fetāla seruma, 1,2 U/ml penicilīna un 1,2 μg/ml streptomicīna, 37°C inkubatorā ar 5% CO2.
Visi šajā manuskriptā aprakstītie eksperimenti tika veikti saskaņā ar Japānas biodrošības noteikumiem un vadlīnijām.
Savienojumi tika izšķīdināti dimetilsulfoksīdā (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kā izejas šķīdumi un atšķaidīti MS vidē Arabidopsis un tabakai vai Gamborg B5 vidē aknu misai. Sakņu augšanas inhibīcijas testam vairāk nekā 10 sēklas uz plates tika iesētas uz agara barotnes, kas satur norādītos savienojumus vai DMSO. Sēklas tika inkubētas augšanas kamerā 7 dienas. Stādi tika fotografēti un tika mērīts sakņu garums. Arabidopsis dīgtspējas testam 48 sēklas uz plates tika iesētas uz agara barotnes, kas satur 200 μM savienojuma vai DMSO. Arabidopsis sēklas tika audzētas augšanas kamerā, un dīgto stādu skaits tika skaitīts 7 dienas pēc dīgšanas (dag). Tabakas dīgtspējas testam 24 sēklas uz plates tika iesētas uz agara barotnes, kas satur 200 μM KAND vai DMSO. Tabakas sēklas tika audzētas augšanas kamerā, un dīgto stādu skaits tika skaitīts pēc 14 dienām. Aknu misas augšanas inhibīcijas testam 9 embriji no katras plāksnes tika uzklāti uz agara barotnes, kas satur norādītās KAND vai DMSO koncentrācijas, un inkubēti augšanas kamerā 14 dienas.
Izmantojiet stādus, kas iekrāsoti ar 5 mg/ml propīdija jodīda (PI), lai vizualizētu sakņu meristēmu organizāciju. PI signāli tika novēroti ar fluorescences mikroskopiju, izmantojot TCS SPE konfokālo lāzera skenēšanas mikroskopu (Leica Microsystems).
Sakņu histoķīmiskā krāsošana ar β-glikuronidāzi (GUS) tika veikta saskaņā ar Malami un Benfeja aprakstīto protokolu36. Stādi tika fiksēti 90% acetonā uz nakti, iekrāsoti ar 0,5 mg/ml 5-brom-4-hlor-3-indolil-β-d-glikuronskābi GUS buferšķīdumā 1 stundu un ievietoti hidratētā hloraldehīda šķīdumā (8 g hlorālhidrāta, 2 ml ūdens un 1 ml glicerīna) un novēroti ar diferenciālās interferences kontrasta mikroskopiju, izmantojot Axio Imager M1 mikroskopu (Carl Zeiss).
Sakņu leņķi tika mērīti 7 dienas veciem stādiem, kas audzēti uz vertikāli novietotām plāksnēm. Saknes leņķi mēra no gravitācijas vektora virziena, kā aprakstīts 6. solī.
Kortikālo mikrotubulu izvietojums tika novērots, kā aprakstīts, ar nelielām protokola izmaiņām 37. Kā primārās un sekundārās antivielas tika izmantotas antivielas pret β-tubulīnu (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) un Alexa Fluor 488 konjugēts anti-peles IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) attiecīgi atšķaidījumos 1:1000 un 1:100. Fluorescences attēli tika iegūti, izmantojot TCS SPE konfokālo lāzera skenēšanas mikroskopu (Leica Microsystems). Iegūstiet Z-kaudzes attēlus un izveidojiet maksimālās intensitātes projekcijas saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
HeLa šūnu proliferācijas tests tika veikts, izmantojot Cell Counting Kit 8 (Dojindo) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
E. coli DH5α augšanu analizēja, mērot šūnu blīvumu kultūrā, izmantojot spektrofotometru pie 600 nm (OD600).
Citoskeleta organizācija transgēnās BY-2 šūnās tika novērota, izmantojot fluorescences mikroskopu, kas aprīkots ar CSU-X1 konfokālās skenēšanas ierīci (Yokogawa) un sCMOS kameru (Zyla, Andor Technology). Citoskeleta blīvums tika novērtēts ar attēlu analīzi, kas kvantitatīvi noteica citoskeleta pikseļu procentuālo daudzumu citoplazmas pikseļos konfokālajos attēlos, izmantojot ImageJ programmatūru, kā aprakstīts38,39.
Lai noteiktu šūnu nāvi BY-2 šūnās, šūnu suspensijas alikvota tika inkubēta ar 0,05% Evansa zilo krāsvielu 10 minūtes istabas temperatūrā. Mirušo šūnu selektīva Evansa zilā krāsošana ir atkarīga no krāsvielas ekstrūzijas no dzīvotspējīgām šūnām ar neskartas plazmas membrānas palīdzību40. Iekrāsotās šūnas tika novērotas, izmantojot spilgtā lauka mikroskopu (BX53, Olympus).
HeLa šūnas tika audzētas DMEM vidē, kas papildināta ar 10% FBS, mitrinātā inkubatorā 37°C temperatūrā un 5% CO2 atmosfērā. Šūnas tika apstrādātas ar 100 μM KAND 11, kumamonāmskābi 6, kumamonamīdu 1, 100 ng/ml kolcemīdu (Gibco) vai 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 stundas 37°C temperatūrā. Šūnas tika fiksētas ar MetOH 10 minūtes un pēc tam ar acetātu 5 minūtes istabas temperatūrā. Fiksētās šūnas tika inkubētas ar β-tubulīna primāro antivielu (1D4A4, Proteintech: 66240-1), kas atšķaidīta ar 0,5% BSA/PBS, 2 stundas, 3 reizes mazgātas ar TBST un pēc tam inkubētas ar Alexa Fluor kazas antivielu. 488 1 stunda. – Peles IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) un 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI), atšķaidīta ar 0,5% BSA/PBS. Pēc trīskāršas mazgāšanas ar TBST iekrāsotās šūnas tika novērotas ar Nikon Eclipse Ti-E apgriezto mikroskopu. Attēli tika uzņemti ar atdzesētu Hamamatsu ORCA-R2 CCD kameru, izmantojot MetaMorph programmatūru (Molecular Devices).
Publicēšanas laiks: 2024. gada 17. jūnijs