Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts.Lai iegūtu vislabākos rezultātus, ieteicams izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Tikmēr, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stila vai JavaScript.
Dabisku produktu atklāšana un lietderīga izmantošana var palīdzēt uzlabot cilvēka dzīvi.Augu augšanu kavējošās ķīmiskās vielas plaši izmanto kā herbicīdus nezāļu apkarošanai.Sakarā ar nepieciešamību izmantot dažāda veida herbicīdus, ir nepieciešams identificēt savienojumus ar jauniem darbības mehānismiem.Šajā pētījumā mēs atklājām jaunu N-alkoksipirola savienojumu, kumamonamīdu, no Streptomyces werraensis MK493-CF1 un izveidojām pilnīgu sintēzes procesu.Izmantojot bioloģiskās aktivitātes testus, mēs atklājām, ka urs-monoamīnskābe ir sintētisks urs-monoamīda starpprodukts un potenciālsaugu augšanas inhibitors.Turklāt mēs esam izstrādājuši dažādus urbenonskābes atvasinājumus, tostarp urbeniloksi atvasinājumu (UDA), kam ir augsta herbicīda aktivitāte, negatīvi neietekmējot HeLa šūnu augšanu.Mēs arī atklājām, ka urmotonskābes atvasinājumi izjauc augu mikrotubulas;turklāt KAND ietekmē aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi;Šīs daudzpusīgās iedarbības atšķiras no zināmajiem mikrotubulu inhibitoriem un liecina par jaunu ursonskābes darbības mehānismu, kas ir svarīga priekšrocība jaunu herbicīdu izstrādē.
Labvēlīgu dabas produktu un to atvasinājumu atklāšana un praktiska pielietošana ir līdzeklis cilvēka dzīves kvalitātes uzlabošanai.Sekundārie metabolīti, ko ražo mikroorganismi, augi un kukaiņi, ir noveduši pie ievērojama progresa medicīnā un lauksaimniecībā.Daudzas antibiotikas un zāles pret leikēmiju ir izstrādātas no dabīgiem produktiem.Turklāt dažāda veidapesticīdi, no šiem dabiskajiem produktiem tiek iegūti fungicīdi un herbicīdi izmantošanai lauksaimniecībā.Jo īpaši nezāļu apkarošanas herbicīdi ir svarīgi instrumenti kultūraugu ražas palielināšanai mūsdienu lauksaimniecībā, un komerciāli jau tiek izmantoti dažāda veida savienojumi.Vairāki šūnu procesi augos, piemēram, fotosintēze, aminoskābju metabolisms, šūnu sieniņu sintēze, mitozes regulēšana, fitohormonu signalizācija vai proteīnu sintēze, tiek uzskatīti par tipiskiem herbicīdu mērķiem.Savienojumi, kas kavē mikrotubulu darbību, ir izplatīta herbicīdu klase, kas ietekmē augu augšanu, ietekmējot mitotisko regulējumu2.
Mikrotubulas ir citoskeleta sastāvdaļas un ir plaši konservētas eikariotu šūnās.Tubulīna heterodimērs sastāv no α-tubulīna un β-tubulīna, kas veido lineārus mikrotubulu protofilamentus, un 13 protofilamenti veido cilindrisku struktūru.Mikrotubulām ir vairākas lomas augu šūnās, tostarp nosaka šūnu formu, šūnu dalīšanos un intracelulāro transportu3,4.Augu šūnas satur mikrotubulas zem starpfāzu plazmas membrānas, un tiek uzskatīts, ka šīs tā sauktās garozas mikrotubulas kontrolē celulozes mikrofibrilu organizāciju, regulējot celulozes sintāzes kompleksus4,5.Sakņu epidermas šūnu garozas mikrotubulas, kas atrodas saknes gala straujā pagarinājuma zonā, atrodas sāniski, un celulozes mikrošķiedras seko šīm mikrotubulām un ierobežo šūnu izplešanās virzienu, tādējādi veicinot anizotropo šūnu pagarināšanos.Tāpēc mikrotubulu funkcija ir cieši saistīta ar augu morfoloģiju.Aminoskābju aizstāšana gēnos, kas kodē tubulīnu, izraisa kortikālo mikrotubulu bloku novirzes un augšanu kreisajā vai labajā pusē Arabidopsis 6, 7.Tāpat mutācijas ar mikrotubuliem saistītos proteīnos, kas regulē mikrotubulu dinamiku, var izraisīt arī izkropļotu sakņu augšanu 8, 9, 10, 11, 12, 13.Turklāt apstrāde ar mikrotubulus graujošiem herbicīdiem, piemēram, dizopiramīdu, kas pazīstams arī kā pretilahlors, izraisa arī kreisās puses slīpo sakņu augšanu14.Šie dati liecina, ka precīza mikrotubulu funkcijas regulēšana ir būtiska, lai noteiktu augu augšanas virzienu.
Ir atklāti dažāda veida mikrotubulu inhibitori, un šīs zāles ir devušas būtisku ieguldījumu citoskeleta izpētē, kā arī lauksaimniecībā un medicīnā2.Jo īpaši orizalīns, dinitroanilīna savienojumi, dizopiramīds, ar benzamīdu saistīti savienojumi un to analogi var kavēt mikrotubulu darbību un tādējādi kavēt augu augšanu.Tāpēc tos plaši izmanto kā herbicīdus.Tomēr, tā kā mikrotubulas ir svarīga augu un dzīvnieku šūnu sastāvdaļa, lielākā daļa mikrotubulu inhibitoru ir citotoksiski abiem šūnu tipiem.Tāpēc, neskatoties uz to, ka tie ir atzīti par herbicīdiem, praktiskiem mērķiem tiek izmantots ierobežots skaits pretmikrotubulu līdzekļu.
Streptomyces ir Streptomyces dzimtas ģints, kas ietver aerobās, grampozitīvās, pavedienveida baktērijas un ir plaši pazīstama ar spēju ražot plašu sekundāro metabolītu klāstu.Tāpēc tas tiek uzskatīts par vienu no svarīgākajiem jaunu bioloģiski aktīvo dabas produktu avotiem.Pašreizējā pētījumā mēs atklājām jaunu savienojumu, ko sauc par kumamonamīdu, kas tika izolēts no Streptomyces werraensis MK493-CF1 un S. werraensis ISP 5486. Izmantojot spektrālo analīzi un pilnu spektrālo analīzi, tika raksturota kumamonamīda struktūra un tās unikālais N-alkoksipirola skelets. tika noteikts.sintēze.Tika konstatēts, ka ursmonskābe, ursmonoamīda un tā atvasinājumu sintētiskais starpprodukts, kavē populārā paraugauga Arabidopsis thaliana augšanu un dīgšanu.Struktūras un aktivitātes attiecību pētījumā mēs atklājām, ka savienojums ar C9, kas modificēts par ursonskābi, ko sauc par ursonskābes noniloksi atvasinājumu (KAND), ievērojami uzlabo augšanas un dīgtspējas inhibējošo iedarbību.Proti, jaunatklātais augu augšanas inhibitors ietekmēja arī tabakas un aknu augšanas augšanu un nebija citotoksisks baktērijām vai HeLa šūnām.Turklāt daži urmotonskābes atvasinājumi izraisa izkropļotu sakņu fenotipu, kas nozīmē, ka šie atvasinājumi tieši vai netieši ietekmē mikrotubulas.Saskaņā ar šo ideju mūsu novērojumi par mikrotubulām, kas marķētas vai nu imūnhistoķīmiski, vai ar fluorescējošiem proteīniem, liecina, ka KAND apstrāde depolimerizē mikrotubulas.Turklāt apstrāde ar kumamotonskābes atvasinājumiem izjauca aktīna mikrofilamentus.Tādējādi mēs esam atklājuši jaunu augu augšanas inhibitoru, kura unikālais darbības mehānisms ir saistīts ar citoskeleta iznīcināšanu.
Celms MK493-CF1 tika izolēts no augsnes Shinagawa-ku, Tokijā.Celms MK493-CF1 veidoja labi sazarotu stromas micēliju.Tika noteikta 16S ribosomu RNS gēna daļējā secība (1422 bp).Šis celms ir ļoti līdzīgs S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipisks celms, 99,93%).Pamatojoties uz šo rezultātu, tika noteikts, ka šis celms ir cieši saistīts ar S. werraensis tipa celmu.Tāpēc mēs provizoriski nosaucām šo celmu S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T arī ražo tādus pašus bioaktīvos savienojumus.Tā kā sākotnēji bija maz pētījumu par dabisko produktu iegūšanu no šī mikroorganisma, tika veikti turpmāki ķīmiskie pētījumi.Pēc S. werraensis MK493-CF1 kultivēšanas uz miežu barotnes ar cietvielu fermentāciju 30°C 14 dienas, barotne tika ekstrahēta ar 50% EtOH.60 ml parauga tika žāvēti, lai iegūtu 59,5 mg neapstrādāta ekstrakta.Neapstrādāts ekstrakts tika pakļauts reversās fāzes HPLC, lai iegūtu N-metoksi-1H-pirola-2-karboksamīdu (1, nosaukts kumamonamīds, 36,0 mg).Kopējais 1 daudzums ir aptuveni 60% no neapstrādātā ekstrakta.Tāpēc mēs nolēmām detalizēti izpētīt kumamotoamīda 1 īpašības.
Coumamonamide 1 ir balts amorfs pulveris, un augstas izšķirtspējas masas spektrometrija (HRESIMS) apstiprina C6H8N2O2 (1. att.).Šī savienojuma C2-aizvietoto pirola fragmentu raksturo δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH 1H KMR spektrā: 4,5 Hz , H-5) un δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), un 13C KMR spektrs parāda četru sp2 oglekļa atomu klātbūtni.Amīda grupas klātbūtne C2 pozīcijā tika novērtēta ar HMBC korelāciju no C-3 protona līdz amīda karbonilogleklim pie δC 161,1.Turklāt 1H un 13C NMR maksimumi pie δH 4,10 (3H, S) un δC 68,3 norāda uz N-metoksigrupu klātbūtni molekulā.Lai gan pareizā metoksigrupas pozīcija vēl nebija noteikta, izmantojot spektroskopisko analīzi, piemēram, uzlaboto atšķirību spektroskopiju un kodolenerģijas Overhauzera saīsinājumu (NOEDF), N-metoksi-1H-pirola-2-karboksamīds kļuva par pirmo kandidāta savienojumu.
Lai noteiktu 1 pareizo struktūru, tika veikta totālā sintēze (2.a att.).Tirdzniecībā pieejamā 2-aminopiridīna 2 apstrāde ar m-CPBA radīja atbilstošo N-oksīdu 3 kvantitatīvā iznākumā.Pēc 2 2-aminoazidēšanas Abramoviča aprakstītā ciklokondensācijas reakcija tika veikta benzolā 90 ° C temperatūrā, lai iegūtu vēlamo 1-hidroksi-1H-pirola-2-karbonitrilu 5 gramos.Ātrums 60% (divi posmi).15,16.Pēc 4 metilēšanas un hidrolīzes tika iegūta 1-metoksi-1H-pirol-2-karbonskābe (saukta par "kumotonskābi", 6) ar labu iznākumu (70%, divi soļi).Visbeidzot, amidēšana ar skābes hlorīda starpproduktu 6, izmantojot amonjaka ūdens šķīdumu, deva Kumamoto amīdu 1 ar 98% iznākumu.Visi sintezētā 1 spektrālie dati bija līdzīgi izolētajam 1, tāpēc tika noteikta 1 struktūra;
Urbenamīda un urbenskābes bioloģiskās aktivitātes vispārējā sintēze un analīze.a ) Kumamoto amīda kopējā sintēze.( b ) Septiņas dienas veci savvaļas tipa Arabidopsis Columbia (Col) stādi tika audzēti uz Murashige un Skoog (MS) plāksnēm, kas satur kumamonamīdu 6 vai kumamonamīdu 1 norādītajās koncentrācijās.Mēroga josla = 1 cm.
Pirmkārt, mēs novērtējām urbenamīda un tā starpproduktu bioloģiskās aktivitātes attiecībā uz to spēju modulēt augu augšanu.Mēs pievienojām dažādas ursmonamīda 1 vai ursmonskābes 6 koncentrācijas MS agara barotnei un kultivējām Arabidopsis thaliana stādus uz šīs barotnes.Šie testi parādīja, ka augstas koncentrācijas (500 μM) 6 kavē sakņu augšanu (2.b att.).Tālāk mēs ģenerējām dažādus atvasinājumus, aizstājot N1 pozīciju 6, un veicām tiem struktūras un aktivitātes attiecību pētījumus (analoga sintēzes process ir aprakstīts atbalsta informācijā (SI)).Arabidopsis stādus audzēja uz barotnes, kas satur 50 μM ursonskābes atvasinājumus, un tika izmērīts sakņu garums.kā parādīts attēlā.Kā parādīts 3.a, b un S1 attēlā, kumamoskābēm ir dažāda garuma lineāras alkoksi ķēdes (9, 10, 11, 12 un 13) vai lielas alkoksi ķēdes (15, 16 un 17) N1 pozīcijā.Atvasinājumi uzrādīja būtisku sakņu augšanas kavēšanu.Turklāt mēs atklājām, ka 200 μM 10, 11 vai 17 lietošana kavē dīgtspēju (3.c un S2 att.).
Kumamoto amīda un radniecīgo savienojumu struktūras un aktivitātes attiecības izpēte.(a) Analogu struktūra un sintēzes shēma.b ) sakņu garuma kvantitatīva noteikšana 7 dienas veciem stādiem, kas audzēti MS barotnē ar vai bez 50 μM kumamonamīda atvasinājumiem.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar fiktīvu ārstēšanu (t tests, lpp< 0,05).n>18. Dati ir parādīti kā vidēji ± SD.nt nozīmē “nav pārbaudīts”, jo vairāk nekā 50% sēklu nav uzdīgušas.(c) Apstrādāto sēklu dīgtspējas kvantitatīva noteikšana, kas inkubētas 7 dienas MS barotnē ar vai bez 200 μM kumamonamīda un radniecīgiem savienojumiem.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar fiktīvu ārstēšanu (hī kvadrāta tests).n=96.
Interesanti, ka alkilsānu ķēdes, kas garākas par C9, samazināja inhibējošo aktivitāti, kas liecina, ka ar kumamotoīnskābi saistītiem savienojumiem ir nepieciešamas noteikta izmēra sānu ķēdes, lai parādītu to bioloģisko aktivitāti.
Tā kā struktūras un aktivitātes attiecību analīze parādīja, ka C9 tika pārveidots par ursonskābi un ursonskābes noniloksi atvasinājums (turpmāk tekstā KAND 11) bija visefektīvākais augu augšanas inhibitors, mēs veicām detalizētāku KAND 11 raksturojumu. Arabidopsis ārstēšana. ar 50 μM KAND 11 gandrīz pilnībā novērsa dīgtspēju, savukārt zemākas KAND 11 koncentrācijas (40, 30, 20 vai 10 μM) kavēja sakņu augšanu atkarībā no devas (4.a, b att.).Lai pārbaudītu, vai KAND 11 ietekmē sakņu meristēmu dzīvotspēju, mēs pārbaudījām sakņu meristēmas, kas iekrāsotas ar propīdija jodīdu (PI), un izmērīja meristēmu laukuma lielumu.Stādiem, kas audzēti uz barotnes, kas satur 25 μM KAND-11, meristēmas izmērs bija 151,1 ± 32,5 μm, savukārt uz DMSO saturošas kontroles barotnes audzētu stādu meristēmas izmērs bija 264,7 ± 30,8 μm, (4c att.) , kas norāda, ka KAND-11 atjauno šūnu aktivitāti.izplatās.Sakņu meristēma.Atbilstoši tam, apstrāde ar KAND 11 samazināja šūnu dalīšanās marķiera CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signāla daudzumu saknes meristēmā (4.e att.) 17 .Šie rezultāti liecina, ka KAND 11 kavē sakņu augšanu, samazinot šūnu proliferācijas aktivitāti.
Urbenonskābes atvasinājumu (urbeniloksiatvasinājumu) inhibējošās ietekmes uz augšanu analīze.(a) 7 dienas veci savvaļas tipa kolu stādi, kas audzēti MS plāksnēs ar norādītajām KAND 11 koncentrācijām. Mēroga josla = 1 cm.b) saknes garuma kvantitatīva noteikšana.Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, lpp< 0,05).n>16. Dati ir parādīti kā vidēji ± SD.(c) Konfokālā mikroskopija ar propīdija jodīdu iekrāsotām savvaļas tipa Col saknēm, kas audzētas uz MS plāksnēm ar vai bez 25 μM KAND 11. Baltas iekavas norāda saknes meristēmu.Mēroga josla = 100 µm.d) saknes meristēmas lieluma kvantitatīva noteikšana (n = 10 līdz 11).Statistiskās atšķirības tika noteiktas, izmantojot t-testu (lpp< 0,05).Joslas attēlo vidējo meristēmu izmēru.e) diferenciālā interferences kontrasta (DIC) mikroskopija saknes meristēmai, kas satur CDKB2 konstrukciju;1pro: CDKB2;1-GUS iekrāso un iekrāso uz 5 dienu veciem stādiem, kas audzēti uz MS plāksnēm ar 25 µM KAND testu vai bez tā.
KAND 11 fitotoksicitāte tika tālāk pārbaudīta, izmantojot citu divdīgļlapju augu, tabaku (Nicotiana tabacum) un galveno sauszemes augu paraugorganismu, aknu kārpiņu (Marchantia polymorpha).Tāpat kā Arabidopsis gadījumā, tabakas SR-1 stādi, kas audzēti uz barotnes, kas satur 25 μM KAND 11, radīja īsākas saknes (5.a attēls).Turklāt 40 no 48 sēklām dīgst plāksnēs, kas satur 200 μM KAND 11, turpretim visas 48 sēklas dīgušas uz mākslīgi apstrādātas barotnes, norādot, ka augstākas KAND koncentrācijas bija nozīmīgas (p< 0,05;chi tests -kvadrāts) kavēja tabakas dīgtspēju.(5.b att.).Turklāt KAND 11 koncentrācija, kas inhibēja baktēriju augšanu aknu kārpā, bija līdzīga efektīvajai koncentrācijai Arabidopsis (5.c attēls).Šie rezultāti liecina, ka KAND 11 var kavēt dažādu augu augšanu.Pēc tam mēs pētījām ar lāču monoamīdu saistīto savienojumu iespējamo citotoksicitāti citos organismos, proti, cilvēka HeLa šūnās un Escherichia coli celmā DH5α, attiecīgi kā augstāku dzīvnieku un baktēriju šūnu pārstāvji.Virknē šūnu proliferācijas testu mēs novērojām, ka kumamonamīds 1, kumamonamīnskābe 6 un KAND 11 neietekmēja HeLa vai E. coli šūnu augšanu 100 μM koncentrācijās (5.d, e att.).
KAND 11 augšanas kavēšana organismos, kas nav Arabidopsis.(a) Divas nedēļas vecus savvaļas tipa SR-1 tabakas stādus audzēja uz vertikāli novietotām MS plāksnēm, kas satur 25 μM KAND 11. (b) Divas nedēļas vecus savvaļas tipa SR-1 tabakas stādus audzēja uz horizontāli novietotiem. MS plates, kas satur 200 μM KAND 11. (c) Divas nedēļas veci savvaļas tipa Tak-1 aknu pumpuri, kas audzēti Gamborg B5 plāksnēs ar norādītajām KAND 11 koncentrācijām. Sarkanās bultiņas norāda uz sporām, kas pārtrauca augt divu nedēļu inkubācijas laikā. periodā.(d) HeLa šūnu šūnu proliferācijas tests.Dzīvotspējīgo šūnu skaits tika mērīts fiksētos laika intervālos, izmantojot šūnu skaitīšanas komplektu 8 (Dojindo).Kā kontroli HeLa šūnas tika apstrādātas ar 5 μg / ml aktinomicīna D (Act D), kas inhibē RNS polimerāzes transkripciju un izraisa šūnu nāvi.Analīzes tika veiktas trīs eksemplāros.e) E. coli šūnu proliferācijas tests.E. coli augšanu analizēja, mērot OD600.Kā kontroli šūnas tika apstrādātas ar 50 μg/ml ampicilīnu (Amp), kas kavē baktēriju šūnu sienas sintēzi.Analīzes tika veiktas trīs eksemplāros.
Lai atšifrētu ar uramīdu saistīto savienojumu izraisītās citotoksicitātes darbības mehānismu, mēs atkārtoti analizējām urbēnskābes atvasinājumus ar mērenu inhibējošu iedarbību.kā parādīts attēlā.Kā parādīts 2.b un 6.a attēlā, stādi, kas audzēti uz agara plāksnēm, kas satur augstu urmotonskābes 6 koncentrāciju (200 μM), radīja īsākas un pa kreisi izliektas saknes (θ = – 23,7 ± 6,1), savukārt stādiem, kas audzēti uz kontroles barotnes, stādi radīja gandrīz taisnas saknes (θ = – 3,8 ± 7,1).Ir zināms, ka šo raksturīgo slīpo augšanu izraisa kortikālo mikrotubulu disfunkcija 14, 18.Saskaņā ar šo konstatējumu mikrotubulus destabilizējošās zāles dizopiramīds un orizalīns mūsu augšanas apstākļos izraisīja līdzīgu sakņu sasvēršanos (2.b, 6.a att.).Tajā pašā laikā mēs pārbaudījām urmotonskābes atvasinājumus un atlasījām vairākus no tiem, kas noteiktās koncentrācijās izraisīja slīpu sakņu augšanu.8., 9. un 15. savienojumi mainīja sakņu augšanas virzienu attiecīgi pie 75 μM, 50 μM un 40 μM, norādot, ka šie savienojumi var efektīvi destabilizēt mikrotubulas (2.b, 6.a att.).Mēs arī pārbaudījām visspēcīgāko ursolskābes atvasinājumu KAND 11 zemākā koncentrācijā (15 µM) un atklājām, ka KAND 11 lietošana kavē sakņu augšanu un ka sakņu augšanas virziens bija nevienmērīgs, lai gan tiem bija tendence slīdēt pa kreisi ( C3 attēls)..Tā kā augstākas mikrotubulus destabilizējošo zāļu koncentrācijas dažkārt kavē augu augšanu, nevis izraisa sakņu sasvēršanos, mēs pēc tam novērtējām iespēju, ka KAND 11 ietekmē mikrotubulus, novērojot garozas mikrotubulus sakņu epidermas šūnās.Imūnhistoķīmija, izmantojot anti-β-tubulīna antivielas sējeņu sakņu epidermas šūnās, kas apstrādātas ar 25 μM KAND 11, parādīja gandrīz visu kortikālo mikrotubulu izzušanu epidermas šūnās pagarinājuma zonā (6.b att.).Šie rezultāti liecina, ka kumamotonskābe un tās atvasinājumi tieši vai netieši iedarbojas uz mikrotubulām, lai tās izjauktu, un ka šie savienojumi ir jauni mikrotubulu inhibitori.
Ursonskābe un tās atvasinājumi maina Arabidopsis thaliana kortikālos mikrotubulus.a ) saknes slīpuma leņķis, ko mēra dažādu urmotonskābes atvasinājumu klātbūtnē norādītajās koncentrācijās.Tika analizēta arī divu savienojumu, par kuriem zināms, ka tie inhibē mikrotubulus: dizopiramīda un orizalīna, iedarbība.Ielaidums parāda standartu, ko izmanto sakņu augšanas leņķa mērīšanai.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar fiktīvu ārstēšanu (t tests, lpp< 0,05).n>19. Mēroga josla = 1 cm.b ) kortikālās mikrotubulas epidermas šūnās pagarinājuma zonā.Mikrotubulas savvaļas tipa Arabidopsis Col saknēs, kas audzētas uz MS plāksnēm ar vai bez 25 μM KAND 11, tika vizualizētas ar imūnhistoķīmisku krāsošanu, izmantojot β-tubulīna primārās antivielas un Alexa Fluor konjugētas sekundārās antivielas.Mēroga josla = 10 µm.c ) mikrotubulu mitotiskā struktūra saknes meristēmā.Mikrotubulas tika vizualizētas, izmantojot imūnhistoķīmisko krāsošanu.Mitotiskās struktūras, tostarp profāzes zonas, vārpstas un fragmoplasti, tika skaitītas no konfokālajiem attēliem.Bultiņas norāda uz mitotiskām mikrotubulu struktūrām.Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām ar fiktīvu ārstēšanu (t tests, lpp< 0,05).n>9. Mēroga josla = 50 µm.
Lai gan Ursa spēj traucēt mikrotubulu darbību, paredzams, ka tās darbības mehānisms atšķirsies no tipiskiem mikrotubulu depolimerizatoriem.Piemēram, lielākas mikrotubulu depolimerizējošu līdzekļu, piemēram, dizopiramīda un orizalīna, koncentrācijas izraisa epidermas šūnu anizotropu izplešanos, bet KAND 11 to nedara.Turklāt KAND 11 un dizopiramīda vienlaicīga lietošana izraisīja kombinētu disopiramīda izraisītu sakņu augšanas reakciju un tika novērota KAND 11 izraisīta augšanas kavēšana (S4 att.).Mēs arī analizējām paaugstinātas jutības disopiramīda 1-1 (phs1-1) mutanta reakciju uz KAND 11. phs1-1 ir nekanoniska tubulīna kināzes punktu mutācija, un, apstrādājot ar dizopiramīdu9,20, tā rada īsākas saknes.phs1-1 mutantu stādiem, kas audzēti agara vidē, kas satur KAND 11, bija īsākas saknes, kas līdzīgas tām, kas audzētas uz disopiramīda (S5 att.).
Turklāt mēs novērojām mitotiskas mikrotubulu struktūras, piemēram, profāzes zonas, vārpstas un fragmoplastus, ar KAND 11 apstrādāto stādu sakņu meristēmā. Saskaņā ar CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS novērojumiem ievērojams samazinājums tika novērots mitotisko mikrotubulu skaits (.6.c att.).
Lai raksturotu KAND 11 citotoksicitāti subcelulārā izšķirtspējā, mēs apstrādājām tabakas BY-2 suspensijas šūnas ar KAND 11 un novērojām to reakciju.Vispirms mēs pievienojām KAND 11 BY-2 šūnām, kas ekspresē TagRFP-TUA6, kas fluorescējoši marķē mikrotubulus, lai novērtētu KAND 11 ietekmi uz kortikālajām mikrotubulām.Kortikālo mikrotubulu blīvums tika novērtēts, izmantojot attēla analīzi, kas kvantitatīvi noteica citoskeleta pikseļu procentuālo daudzumu citoplazmas pikseļos.Testa rezultāti parādīja, ka pēc 1 stundu ilgas apstrādes ar 50 μM vai 100 μM KAND 11 blīvums ievērojami samazinājās līdz attiecīgi 0,94 ± 0,74% vai 0,23 ± 0,28%, bet ar DMSO apstrādāto šūnu blīvums bija 1,64 ± 0,61 % (7.a att.).Šie rezultāti atbilst Arabidopsis novērojumam, ka ārstēšana ar KAND 11 izraisa kortikālo mikrotubulu depolimerizāciju (6.b attēls).Mēs arī pārbaudījām BY-2 līniju ar GFP-ABD iezīmētiem aktīna pavedieniem pēc apstrādes ar tādu pašu KAND 11 koncentrāciju un novērojām, ka apstrāde ar KAND 11 izjauca aktīna pavedienus.Apstrāde ar 50 μM vai 100 μM KAND 11 1 stundu būtiski samazināja aktīna pavedienu blīvumu attiecīgi līdz 1,20 ± 0,62% vai 0,61 ± 0,26%, savukārt blīvums ar DMSO apstrādātajās šūnās bija 1,69 ± 0,51% (F ig 51).7b).Šie rezultāti ir pretrunā ar propizamīda iedarbību, kas neietekmē aktīna pavedienus, un latrunkulīna B, aktīna depolimerizatora, kas neietekmē mikrotubulas (SI S6 attēls).Turklāt apstrāde ar kumamonamīdu 1, kumamonamīda skābi 6 vai KAND 11 neietekmēja mikrotubulus HeLa šūnās (SI S7 attēls).Tādējādi tiek uzskatīts, ka KAND 11 darbības mehānisms atšķiras no zināmo citoskeleta traucējumu mehānisma.Turklāt mūsu mikroskopiskais novērojums par BY-2 šūnām, kas apstrādātas ar KAND 11, atklāja šūnu nāves sākumu KAND 11 apstrādes laikā un parādīja, ka Evansa zili nokrāsoto mirušo šūnu īpatsvars pēc 30 minūšu KAND 11 apstrādes būtiski nepalielinājās, turpretim pēc 90 minūšu ilgas apstrādes ar 50 μM vai 100 μM KAND atmirušo šūnu skaits palielinājās attiecīgi līdz 43,7% vai 80,1% (7.c att.).Kopumā šie dati liecina, ka jaunais ursolskābes atvasinājums KAND 11 ir augiem specifisks citoskeleta inhibitors ar iepriekš nezināmu darbības mehānismu.
KAND ietekmē kortikālās mikrotubulas, aktīna pavedienus un tabakas BY-2 šūnu dzīvotspēju.a ) Kortikālo mikrotubulu vizualizācija BY-2 šūnās TagRFP-TUA6 klātbūtnē.BY-2 šūnas, kas apstrādātas ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO, tika pārbaudītas ar konfokālo mikroskopiju.Kortikālo mikrotubulu blīvums tika aprēķināts no 25 neatkarīgu šūnu mikrogrāfijām.Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, lpp< 0,05).Mēroga josla = 10 µm.( b ) kortikālie aktīna pavedieni BY-2 šūnās, kas vizualizēti GFP-ABD2 klātbūtnē.BY-2 šūnas, kas apstrādātas ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO, tika pārbaudītas ar konfokālo mikroskopiju.Kortikālo aktīna pavedienu blīvums tika aprēķināts no 25 neatkarīgu šūnu mikrogrāfijām.Burti norāda uz būtiskām atšķirībām (Tukey HSD tests, lpp< 0,05).Mēroga josla = 10 µm.c) Mirušo BY-2 šūnu novērošana ar Evansa zilo krāsošanu.BY-2 šūnas, kas apstrādātas ar KAND 11 (50 μM vai 100 μM) vai DMSO, tika pārbaudītas ar spilgta lauka mikroskopiju.n=3.Mēroga josla = 100 µm.
Jaunu dabisko produktu atklāšana un pielietošana ir devusi ievērojamus panākumus dažādos cilvēka dzīves aspektos, tostarp medicīnā un lauksaimniecībā.Ir veikti vēsturiski pētījumi, lai no dabas resursiem iegūtu derīgus savienojumus.Jo īpaši ir zināms, ka aktinomicīti ir noderīgi kā pretparazītu antibiotikas nematodēm, jo tās spēj ražot dažādus sekundāros metabolītus, piemēram, avermektīnu, ivermektīna un bleomicīna vadošo savienojumu un tā atvasinājumus, ko medicīniski izmanto kā pretvēža līdzekli21, 22.Tāpat no aktinomicītiem ir atklāti dažādi herbicīdu savienojumi, no kuriem daži jau tiek izmantoti komerciāli1,23.Tāpēc aktinomicītu metabolītu analīze, lai izolētu dabiskus produktus ar vēlamo bioloģisko aktivitāti, tiek uzskatīta par efektīvu stratēģiju.Šajā pētījumā mēs atklājām jaunu savienojumu, koumamonamīdu, no S. werraensis un veiksmīgi sintezējām to.Ursonskābe ir urbenamīda un tā atvasinājumu sintētisks starpprodukts.Tas var izraisīt raksturīgu sakņu čokurošanos, uzrādīt mērenu vai spēcīgu herbicīdu aktivitāti un tieši vai netieši bojāt augu mikrotubulas.Tomēr urmotonskābes darbības mehānisms var atšķirties no esošo mikrotubulu inhibitoru darbības mehānisma, jo KAND 11 arī izjauc aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi, kas liecina par regulējošu mehānismu, ar kuru urmotonskābe un tās atvasinājumi ietekmē plašu citoskeleta struktūru klāstu..
Sīkāks urbenonskābes raksturojums palīdzēs labāk izprast urbenonskābes darbības mehānismu.Konkrēti, nākamais mērķis ir novērtēt ursonskābes spēju saistīties ar reducētiem mikrotubuliem, lai noteiktu, vai ursonskābe un tās atvasinājumi tieši iedarbojas uz mikrotubulām un tos depolimerizē, vai arī to darbība izraisa mikrotubulu destabilizāciju.Turklāt gadījumā, ja mikrotubulas nav tiešs mērķis, ursonskābes iedarbības vietas un molekulāro mērķu noteikšana uz augu šūnām palīdzēs tālāk izprast radniecīgo savienojumu īpašības un iespējamos veidus, kā uzlabot herbicīdu aktivitāti.Mūsu bioaktivitātes tests atklāja ursonskābes unikālo citotoksisko spēju augt tādiem augiem kā Arabidopsis thaliana, tabaka un aknu zāle, kamēr netika ietekmētas ne E. coli, ne HeLa šūnas.Ursonskābes atvasinājumu priekšrocība ir neliela toksiska ietekme uz dzīvnieku šūnām, ja tie ir izstrādāti kā herbicīdi izmantošanai atklātos lauksaimniecības laukos.Patiešām, tā kā mikrotubulas ir kopīgas eikariotu struktūras, to selektīva inhibīcija augos ir galvenā prasība herbicīdiem.Piemēram, propizamīds, mikrotubulu depolimerizējošs līdzeklis, kas tieši saistās ar tubulīnu un inhibē polimerizāciju, tiek izmantots kā herbicīds, jo tam ir zema toksicitāte pret dzīvnieku šūnām24.Atšķirībā no dizopiramīda radniecīgiem benzamīdiem ir atšķirīga mērķa specifika.Papildus augu mikrocaurulītēm RH-4032 jeb benzoksamīds inhibē arī attiecīgi dzīvnieku šūnu vai oomicītu mikrotubulus, un zalilamīdu izmanto kā fungicīdu tā zemās fitotoksicitātes dēļ25,26,27.Jaunatklātais lācis un tā atvasinājumi uzrāda selektīvu citotoksicitāti pret augiem, taču ir vērts atzīmēt, ka turpmākas modifikācijas var mainīt to mērķa specifiku, potenciāli nodrošinot papildu atvasinājumus patogēno sēņu vai oomicītu kontrolei.
Urbenonskābes un tās atvasinājumu unikālās īpašības ir noderīgas to izstrādē kā herbicīdiem un izmantošanai kā pētniecības instrumentiem.Citoskeleta nozīme augu šūnu formas kontrolēšanā ir plaši atzīta.Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka augi ir attīstījuši sarežģītus kortikālo mikrotubulu organizācijas mehānismus, kontrolējot mikrotubulu dinamiku, lai pareizi kontrolētu morfoģenēzi.Ir identificēts liels skaits molekulu, kas ir atbildīgas par mikrotubulu aktivitātes regulēšanu, un saistītie pētījumi joprojām turpinās3, 4, 28.Mūsu pašreizējā izpratne par mikrotubulu dinamiku augu šūnās pilnībā neizskaidro kortikālo mikrotubulu organizācijas mehānismus.Piemēram, lai gan gan dizopiramīds, gan orizalīns var depolimerizēt mikrotubulas, dizopiramīds izraisa nopietnus sakņu kropļojumus, savukārt orizalīnam ir salīdzinoši viegla iedarbība.Turklāt mutācijas tubulīnā, kas stabilizē mikrotubulus, arī izraisa destrorotāciju saknēs, savukārt paklitaksels, kas arī stabilizē mikrotubulu dinamiku, to neizraisa.Tāpēc, pētot un identificējot ursolskābes molekulāros mērķus, būtu jāsniedz jauns ieskats augu garozas mikrotubulu regulēšanā.Tāpat turpmākie ķīmisko vielu salīdzinājumi, kas efektīvi veicina izkropļotu augšanu, piemēram, dizopiramīds, un mazāk efektīvas ķīmiskās vielas, piemēram, orizalīns vai kumamotorskābe, sniegs norādes par to, kā notiek izkropļota augšana.
No otras puses, ar aizsardzību saistīti citoskeleta pārkārtojumi ir vēl viena iespēja izskaidrot ursonskābes citotoksicitāti.Patogēna infekcija vai elicitora ievadīšana augu šūnās dažkārt izraisa citoskeleta iznīcināšanu un sekojošu šūnu nāvi29.Piemēram, ir ziņots, ka no oomycete iegūtais kriptoksantīns pirms tabakas šūnu nāves izjauc mikrotubulas un aktīna pavedienus, līdzīgi kā tas notiek ar KAND ārstēšanu 30, 31 .Līdzības starp aizsardzības reakcijām un ursonskābes izraisītajām šūnu reakcijām lika mums izvirzīt hipotēzi, ka tās izraisa kopīgus šūnu procesus, lai gan ir acīmredzama ātrāka un spēcīgāka ursonskābes iedarbība nekā kriptoksantīnam.Tomēr pētījumi ir parādījuši, ka aktīna pavedienu pārtraukšana veicina spontānu šūnu nāvi, ko ne vienmēr pavada mikrotubulu darbības traucējumi29.Turklāt vēl ir jānoskaidro, vai patogēns vai izsaucējs izraisa izkropļotu sakņu augšanu, kā to dara ursonskābes atvasinājumi.Tādējādi molekulārās zināšanas, kas saista aizsardzības reakcijas un citoskeletu, ir pievilcīga problēma, kas jārisina.Izmantojot zemas molekulmasas savienojumus, kas saistīti ar ursonskābi, kā arī virkni atvasinājumu ar dažādu potenciālu, tie var nodrošināt iespējas mērķēt uz nezināmiem šūnu mehānismiem.
Kopumā jaunu savienojumu, kas modulē mikrotubulu dinamiku, atklāšana un pielietošana nodrošinās spēcīgas metodes, lai risinātu sarežģītos molekulāros mehānismus, kas ir augu šūnu formas noteikšanas pamatā.Šajā kontekstā nesen izstrādātais savienojums urmotonskābe, kas ietekmē mikrotubulus un aktīna pavedienus un izraisa šūnu nāvi, var sniegt iespēju atšifrēt saikni starp mikrotubulu kontroli un šiem citiem mehānismiem.Tādējādi ķīmiskā un bioloģiskā analīze, izmantojot urbenonskābi, palīdzēs mums izprast molekulāros regulējošos mehānismus, kas kontrolē augu citoskeletu.
Inokulēt S. werraensis MK493-CF1 500 ml izkliedētā Erlenmeijera kolbā, kas satur 110 ml sēklu barotnes, kas sastāv no 2% (w/v) galaktozes, 2% (w/v) Essence pastas, 1% (w/v) Bacto sastāva .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) kukurūzas ekstrakts (KOGOSTCH Co., Ltd., Japāna), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 un 0,2% CaCO3 dejonizētā ūdenī.(pH 7,4 pirms sterilizācijas).Sēklu kultūras tika inkubētas uz rotācijas kratītāja (180 apgr./min) 27 ° C temperatūrā 2 dienas.Ražošanas kultivēšana, izmantojot cietvielu fermentāciju.Sēklu kultūra (7 ml) tika pārnesta 500 ml K-1 kolbā, kurā bija 40 g ražošanas barotnes, kas sastāvēja no 15 g presētu miežu (MUSO Co., Ltd., Japāna) un 25 g dejonizēta ūdens (pH nav koriģēts). pirms sterilizācijas).).Fermentācija tika veikta 30 ° C temperatūrā tumsā 14 dienas.Fermentācijas materiāls tika ekstrahēts ar 40 ml/pudelē EtOH un centrifugēts (1500 g, 4°C, 10 min).Kultūras supernatants (60 ml) tika ekstrahēts ar 10% MeOH/EtOAc maisījumu.Organiskais slānis tika iztvaicēts pazeminātā spiedienā, lai iegūtu atlikumu (59,5 mg), kas tika pakļauts HPLC ar gradienta eluēšanu (0–10 minūtes: 90%) apgrieztās fāzes kolonnā (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × garums 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minūtes: 90% H2O/CH3CN līdz 70% H2O/CH3CN (gradients), 35–45 minūtes: 90% H2O/EtOH, 45–155 minūtes: 90% H2O /EtOH līdz 100% EtOH (gradients (gradients), 155–200 min: 100% EtOH) ar plūsmas ātrumu 1,5 ml / min, kumamonamīds (1, 36,0 mg) tika izolēts kā balts amorfs pulveris.
Kumamotoamīds (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-KMR (125 MHz, CDCl3) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ aprēķinātā vērtība: 141,0659, izmērītā vērtība: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 157 cm–15.
Kolumbijas sēklas (Col-0) tika iegūtas no Arabidopsis Bioloģisko resursu centra (ABRC) ar atļauju izmantošanai pētniecībā.Col-0 sēklas tika pavairotas un uzturētas mūsu laboratorijas apstākļos un izmantotas kā savvaļas tipa Arabidopsis augi.Arabidopsis sēklas tika sterilizētas un kultivētas pusstiprā Murashige un Skoog barotnē, kas satur 2% saharozes (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etānsulfonskābes (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) un 1,5% agara (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C un pastāvīgā apgaismojumā.phs1-1 mutanta sēklas nodrošināja T. Hashimoto (Nara Zinātnes un tehnoloģiju institūts).
SR-1 celma sēklas nodrošināja T. Hashimoto (Nara Zinātnes un tehnoloģiju institūts) un izmantoja kā savvaļas tabakas augus.Tabakas sēklas tika sterilizētas ar virsmu un trīs naktis mērcētas sterilā ūdenī, lai veicinātu dīgtspēju, pēc tam ievietotas pusspēcīgā šķīdumā, kas satur 2% saharozes, 0,05% (w/v) MES un 0,8% gelāna sveķus (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murašige.un Skoog barotne) ar pH 5,7 un inkubēja 23 °C temperatūrā pastāvīgā apgaismojumā.
Celmu Tak-1 nodrošināja T. Kohchi (Kioto universitāte), un to izmantoja kā standarta eksperimentālo vienību aknu sēnīšu pētījumam.Gemma tika iegūta no sterilizētiem kultivētiem augiem un pēc tam tika uzklāta uz Gamborg B5 barotnes (Fujifilm Wako Pure Chemical), kas satur 1% saharozes un 0, 3% gelāna sveķu, un inkubēja 23 ° C temperatūrā nepārtrauktā gaismā.
Tabakas BY-2 šūnas (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) nodrošināja S. Hasezawa (Tokijas Universitāte).BY-2 šūnas tika atšķaidītas 95 reizes modificētā Linsmeiera un Skūga barotnē un katru nedēļu papildinātas ar 2,4-dihlorfenoksietiķskābi32.Šūnu suspensija tika sajaukta ar rotējošu kratītāju ar ātrumu 130 apgr./min 27 ° C temperatūrā tumsā.Šūnas mazgā ar 10 reizes lielāku svaigas barotnes tilpumu un atkārtoti suspendē tajā pašā barotnē.BY-2 transgēnās šūnu līnijas, kas stabili ekspresē mikrotubulu marķieri TagRFP-TUA6 vai aktīna pavedienu marķieri GFP-ABD2 zem ziedkāpostu mozaīkas vīrusa 35S promotora, tika ģenerētas, kā aprakstīts 33, 34, 35.Šīs šūnu līnijas var uzturēt un sinhronizēt, izmantojot procedūras, kas ir līdzīgas tām, kuras tika izmantotas sākotnējai BY-2 šūnu līnijai.
HeLa šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM) (Life Technologies), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 1,2 U/ml penicilīna un 1,2 μg/ml streptomicīna 37°C inkubatorā ar 5% CO2.
Visi šajā manuskriptā aprakstītie eksperimenti tika veikti saskaņā ar Japānas bioloģiskās drošības noteikumiem un vadlīnijām.
Savienojumi tika izšķīdināti dimetilsulfoksīdā (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) kā izejas šķīdumi un atšķaidīti MS barotnē Arabidopsis un tabakas vai Gamborg B5 barotnē aknu zālei.Sakņu augšanas kavēšanas testam vairāk nekā 10 sēklas vienā plāksnē tika iesētas agara barotnē, kas satur norādītos savienojumus vai DMSO.Sēklas inkubēja augšanas kamerā 7 dienas.Stādi tika nofotografēti un izmērīts sakņu garums.Arabidopsis dīgtspējas testam 48 sēklas uz plāksni tika iesētas agara barotnē, kas satur 200 μM savienojumu vai DMSO.Arabidopsis sēklas tika audzētas augšanas kamerā, un uzdīgušo stādu skaits tika skaitīts 7 dienas pēc dīgšanas (dag).Tabakas dīgtspējas noteikšanai 24 sēklas uz plāksni tika iesētas agara barotnē, kas satur 200 μM KAND vai DMSO.Tabakas sēklas tika audzētas augšanas kamerā, un pēc 14 dienām tika skaitīts uzdīgušo stādu skaits.Lai veiktu aknu augšanas kavēšanas testu, 9 embriji no katras plāksnes tika uzklāti uz agara barotnes, kas satur norādītās KAND vai DMSO koncentrācijas, un inkubēti augšanas kamerā 14 dienas.
Izmantojiet stādus, kas iekrāsoti ar 5 mg/ml propīdija jodīdu (PI), lai vizualizētu sakņu meristēmu organizāciju.PI signāli tika novēroti ar fluorescences mikroskopiju, izmantojot TCS SPE konfokālo lāzera skenēšanas mikroskopu (Leica Microsystems).
Sakņu histoķīmiskā krāsošana ar β-glikuronidāzi (GUS) tika veikta saskaņā ar Malami un Benfey36 aprakstīto protokolu.Stādi tika fiksēti 90% acetonā uz nakti, 1 stundu iekrāsoti ar 0, 5 mg / ml 5-brom-4-hlor-3-indolil-β-d-glikuronskābi GUS buferšķīdumā un ievietoti hidratētā hloraldehīda šķīdumā.(8 g hlorālhidrāta, 2 ml ūdens un 1 ml glicerīna) un novērota ar diferenciālās interferences kontrasta mikroskopu, izmantojot Axio Imager M1 mikroskopu (Carl Zeiss).
Sakņu leņķi tika mērīti 7 dienas veciem stādiem, kas audzēti uz vertikāli novietotām plāksnēm.Izmēriet saknes leņķi no gravitācijas vektora virziena, kā aprakstīts 6. darbībā.
Kortikālo mikrotubulu izvietojums tika novērots, kā aprakstīts, ar nelielām izmaiņām protokolā37.Anti-β-tubulīna antivielas (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) un Alexa Fluor 488 konjugēts anti-peles IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) tika izmantotas kā primārās un sekundārās antivielas 1:1000 un 1:100 atšķaidījumos, attiecīgi.Fluorescences attēli tika iegūti, izmantojot TCS SPE konfokālo lāzera skenēšanas mikroskopu (Leica Microsystems).Iegūstiet Z-stack attēlus un izveidojiet maksimālās intensitātes projekcijas saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
HeLa šūnu proliferācijas tests tika veikts, izmantojot šūnu skaitīšanas komplektu 8 (Dojindo) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
E. coli DH5α augšana tika analizēta, mērot šūnu blīvumu kultūrā, izmantojot spektrofotometru pie 600 nm (OD600).
Citoskeleta organizācija transgēnās BY-2 šūnās tika novērota, izmantojot fluorescences mikroskopu, kas aprīkots ar CSU-X1 konfokālās skenēšanas ierīci (Yokogawa) un sCMOS kameru (Zyla, Andor Technology).Citoskeleta blīvums tika novērtēts ar attēla analīzi, kas kvantitatīvi noteica citoskeleta pikseļu procentuālo daudzumu citoplazmas pikseļu vidū konfokālos attēlos, izmantojot ImageJ programmatūru, kā aprakstīts 38, 39.
Lai noteiktu šūnu nāvi BY-2 šūnās, šūnu suspensijas alikvotu daļu inkubēja ar 0, 05% Evans Blue 10 minūtes istabas temperatūrā.Atmirušo šūnu selektīvā Evansa zilā krāsošana ir atkarīga no krāsvielas ekstrūzijas no dzīvotspējīgām šūnām ar neskarto plazmas membrānu40.Krāsotas šūnas tika novērotas, izmantojot spilgta lauka mikroskopu (BX53, Olympus).
HeLa šūnas tika audzētas DMEM, kas papildināts ar 10% FBS, mitrinātā inkubatorā 37 ° C temperatūrā un 5% CO2.Šūnas tika apstrādātas ar 100 μM KAND 11, kumamonamskābi 6, kumamonamīdu 1, 100 ng/ml kolcemīdu (Gibco) vai 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 stundas 37 °C temperatūrā.Šūnas tika fiksētas ar MetOH 10 minūtes un pēc tam ar acetātu 5 minūtes istabas temperatūrā.Fiksētās šūnas 2 stundas inkubēja ar β-tubulīna primāro antivielu (1D4A4, Proteintech: 66240-1), kas atšķaidīta 0, 5% BSA/PBS, 3 reizes nomazgāja ar TBST un pēc tam inkubēja ar Alexa Fluor kazas antivielu.488 1 stunda.– Peļu IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) un 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindols (DAPI), kas atšķaidīts ar 0,5% BSA/PBS.Pēc trīs reizes mazgāšanas ar TBST iekrāsotās šūnas tika novērotas Nikon Eclipse Ti-E apgrieztā mikroskopā.Attēli tika uzņemti ar atdzesētu Hamamatsu ORCA-R2 CCD kameru, izmantojot MetaMorph programmatūru (Molecular Devices).
Publicēšanas laiks: 17. jūnijs 2024