Priežu nematode ir karantīnas migrējošs endoparazīts, kas rada nopietnus ekonomiskus zaudējumus priežu meža ekosistēmās. Šajā pētījumā ir apskatīta halogenēto indolu nematocīdā aktivitāte pret priežu nematodēm un to darbības mehānisms. 5-jodoindola un avermektīna (pozitīvā kontrole) nematocīdās aktivitātes pret priežu nematodēm bija līdzīgas un augstas zemās koncentrācijās (10 μg/ml). 5-jodoindols samazināja auglību, reproduktīvo aktivitāti, embrionālo un kāpuru mirstību un lokomotoro uzvedību. Ligandu molekulārā mijiedarbība ar bezmugurkaulniekiem specifiskiem glutamāta hlorīda kanālu receptoriem apstiprina domu, ka 5-jodoindols, tāpat kā avermektīns, cieši saistās ar receptoru aktīvo vietu. 5-jodoindols arī izraisīja dažādas fenotipiskas deformācijas nematodēs, tostarp patoloģisku orgānu sabrukumu / saraušanos un palielinātu vakuolizāciju. Šie rezultāti liecina, ka vakuoliem var būt nozīme nematodes metilēšanas izraisītā nāvē. Svarīgi, ka 5-jodoindols nebija toksisks abām augu sugām (kāpostiem un redīsiem). Tādējādi šis pētījums parāda, ka jodoindola lietošana vides apstākļos var kontrolēt priežu vīšanas bojājumus.
Priedes koksnes nematode (Bursaphelenchus xylophilus) pieder priežu koksnes nematodēm (PWN), migrējošām endoparazītu nematodēm, kas, kā zināms, rada nopietnus ekoloģisku kaitējumu priežu meža ekosistēmām1. Priežu koksnes nematodes izraisītā priežu vīšanas slimība (PWD) kļūst par nopietnu problēmu vairākos kontinentos, tostarp Āzijā un Eiropā, un Ziemeļamerikā nematode iznīcina introducētās priežu sugas1,2. Priežu samazināšanās ir liela ekonomiska problēma, un tās globālās izplatības izredzes ir satraucošas3. Visbiežāk nematodes uzbrūk šādām priežu sugām: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii un Pinus radiata4. Priežu nematode ir nopietna slimība, kas var nogalināt priedes nedēļu vai mēnešu laikā pēc inficēšanās. Turklāt priežu nematodes uzliesmojumi ir izplatīti dažādās ekosistēmās, tāpēc ir izveidotas noturīgas infekcijas ķēdes1.
Bursaphelenchus xylophilus ir karantīnas augu-parazītu nematode, kas pieder Aphelenchoidea virsdzimtai un 102.5. kladei. Nematode barojas ar sēnēm un vairojas priežu koksnes audos, attīstoties četrās dažādās kāpuru stadijās: L1, L2, L3, L4 un pieaugušā indivīdā1,6. Barības trūkuma apstākļos priežu nematode pāriet specializētā kāpuru stadijā – dauerā, kas parazitē savā vektorā – priežu mizgrauzī (Monochamus alternatus) un tiek pārnesta uz veselām priedēm. Veseliem saimniekiem nematodes ātri migrē caur augu audiem un barojas ar parenhimatozām šūnām, kas izraisa vairākas paaugstinātas jutības reakcijas, priežu vītumu un nāvi gada laikā pēc inficēšanās1,7,8.
Priežu nematožu bioloģiskā kontrole jau sen ir bijis izaicinājums, jo karantīnas pasākumi tika ieviesti 20. gadsimtā. Pašreizējās priežu nematožu apkarošanas stratēģijas galvenokārt ietver ķīmisku apstrādi, tostarp koksnes fumigāciju un nematocīdu implantēšanu koku stumbros. Visbiežāk lietotie nematocīdi ir avermektīns un avermektīna benzoāts, kas pieder avermektīnu saimei. Šīs dārgās ķīmiskās vielas ir ļoti efektīvas pret daudzām nematodu sugām un tiek uzskatītas par videi nekaitīgām9. Tomēr ir sagaidāms, ka šo nematocīdu atkārtota lietošana radīs selekcijas spiedienu, kas gandrīz noteikti izraisīs rezistentu priežu nematožu parādīšanos, kā tas ir pierādīts attiecībā uz vairākiem kukaiņu kaitēkļiem, piemēram, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella un nematodēm Trichostrongylus colubriformis un Ostertagia circumcincta, kurām pakāpeniski ir izveidojusies rezistence pret10. Tāpēc regulāri jāpēta rezistences modeļi un nepārtraukti jāpārbauda nematocīdi, lai atrastu alternatīvus, rentablus un videi draudzīgus pasākumus PVD kontrolei. Pēdējo desmitgažu laikā vairāki autori ir ierosinājuši izmantot augu ekstraktus, ēteriskās eļļas un gaistošas vielas kā nematožu apkarošanas līdzekļus13,14,15,16.
Mēs nesen parādījām indola, starpšūnu un starpvalstu signālu molekulas, nematicīdo aktivitāti Caenorhabditis elegans 17 . Indols ir plaši izplatīts intracelulārs signāls mikrobu ekoloģijā, kas kontrolē daudzas funkcijas, kas ietekmē mikrobu fizioloģiju, sporu veidošanos, plazmīdu stabilitāti, zāļu rezistenci, bioplēves veidošanos un virulenci 18, 19 . Indola un tā atvasinājumu aktivitāte pret citām patogēnām nematodēm nav pētīta. Šajā pētījumā mēs pētījām 34 indolu nematocīdo aktivitāti pret priežu nematodēm un noskaidrojām visspēcīgākā 5-jodoindola darbības mehānismu, izmantojot mikroskopijas, laika intervāla fotografēšanas un molekulārās dokstacijas eksperimentus, un novērtējām tā toksisko ietekmi uz augiem, izmantojot sēklu dīgtspējas testu.
Iepriekš ziņots, ka augstām indola koncentrācijām (> 1, 0 mM) ir nematocīda iedarbība uz nematodēm17. Pēc B. xylophilus (jauktā dzīves posma) apstrādes ar indolu vai 33 dažādiem indola atvasinājumiem pie 1 mM B. xylophilus mirstība tika mērīta, saskaitot dzīvas un mirušas nematodes kontroles un ārstētajā grupā. Pieciem indoliem bija nozīmīga nematicīda aktivitāte; neārstētās kontroles grupas dzīvildze pēc 24 stundām bija 95 ± 7%. No 34 pārbaudītajiem indoliem 5-jodoindols un 4-fluoroindols pie 1 mM izraisīja 100% mirstību, savukārt 5,6-difluoroindigo, metilindola-7-karboksilāts un 7-jodoindols izraisīja aptuveni 50% mirstību (1. tabula).
5-jodoindola ietekme uz priedes koksnes nematodes vakuolu veidošanos un metabolismu. (A) Avermektīna un 5-jodoindola ietekme uz pieaugušiem vīriešu nematodiem, (B) L1 stadijas nematodu olām un (C) B. xylophilus metabolismu, (i) vakuoli netika novēroti 0 stundā, ārstēšana izraisīja (ii) vakuolus, (iii) uzkrāšanos, (iv) vairāku vakuolu pietūkumu, (iv) vakuolu pietūkumu. vakuolu veidošanās un (vi) milzu vakuolu veidošanās. Sarkanās bultiņas norāda uz vakuolu pietūkumu, zilās bultiņas norāda uz vakuolu saplūšanu un melnās bultiņas norāda uz milzīgām vakuolām. Mēroga josla = 50 μm.
Turklāt šajā pētījumā tika aprakstīts arī secīgs metāna izraisītas nāves process priežu nematodēs (4.C attēls). Metanogēnā nāve ir neapoptotisks šūnu nāves veids, kas saistīts ar ievērojamu citoplazmas vakuolu uzkrāšanos . Priežu nematodēs novērotie morfoloģiskie defekti, šķiet, ir cieši saistīti ar metāna izraisītas nāves mehānismu. Mikroskopiskā izmeklēšana dažādos laikos parādīja, ka pēc 20 stundu ilgas 5-jodoindola (0, 1 mM) iedarbības izveidojās milzu vakuoli. Mikroskopiskas vakuolas tika novērotas pēc 8 stundu ilgas ārstēšanas, un to skaits palielinājās pēc 12 stundām. Pēc 14 stundām tika novēroti vairāki lieli vakuoli. Vairākas sapludinātas vakuolas bija skaidri redzamas pēc 12–16 stundu ilgas ārstēšanas, norādot, ka vakuolu saplūšana ir metanogēnās nāves mehānisma pamatā. Pēc 20 stundām visā tārpā tika atrasti vairāki milzu vakuoli. Šie novērojumi ir pirmais ziņojums par metuozi C. elegans .
Ar 5-jodoindolu apstrādātiem tārpiem tika novērota arī vakuolu agregācija un plīsums (5. att.), par ko liecina tārpu izliekšanās un vakuolu izdalīšanās vidē. Vakuolu traucējumi tika novēroti arī olu čaumalas membrānā, ko parasti neskartu saglabā L2 izšķilšanās laikā (papildu attēls S2). Šie novērojumi apstiprina šķidruma uzkrāšanās un osmoregulācijas mazspējas, kā arī atgriezeniskas šūnu traumas (RCI) iesaistīšanos vakuolu veidošanās un pūšanas procesā (5. att.).
Izvirzot hipotēzi par joda lomu novērotajā vakuolu veidošanā, mēs pētījām nātrija jodīda (NaI) un kālija jodīda (KI) nematocīdo aktivitāti. Tomēr koncentrācijās (0,1, 0,5 vai 1 mM) tie neietekmēja ne nematodes izdzīvošanu, ne vakuolu veidošanos (papildu attēls S5), lai gan 1 mM KI bija neliela nematocīda iedarbība. No otras puses, 7-jodoindols (1 vai 2 mM), tāpat kā 5-jodoindols, izraisīja vairākas vakuolas un strukturālas deformācijas (papildu attēls S6). Abiem jodoindoliem priežu nematodēs bija līdzīgas fenotipiskās īpašības, turpretim NaI un KI nebija. Interesanti, ka indols neizraisīja vakuolu veidošanos B. xylophilus pārbaudītajās koncentrācijās (dati nav parādīti). Tādējādi rezultāti apstiprināja, ka indola-joda komplekss ir atbildīgs par B. xylophilus vakuolizāciju un metabolismu.
Starp indoliem, kas pārbaudīti attiecībā uz nematicīdo aktivitāti, 5-jodoindolam bija visaugstākais slīdēšanas indekss -5,89 kcal/mol, kam sekoja 7-jodoindols (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindols (-4,33) un indols (-4,03) (6. attēls). 5-jodoindola spēcīgā ūdeņraža saite ar leicīnu 218 stabilizē tā saistīšanos, savukārt visi pārējie indola atvasinājumi saistās ar serīnu 260, izmantojot sānu ķēdes ūdeņraža saites. Starp citiem modelētajiem jodoindoliem 2-jodoindola saistīšanās vērtība ir -5,248 kcal/mol, kas ir saistīta ar tā galveno ūdeņraža saiti ar leicīnu 218. Citas zināmās saistīšanās vielas ir 3-jodoindols (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindols (-4,0 kcal/mol) un 6,0 kcal (2-fluoroindols). kcal / mol) (papildu attēls S8). Lielākā daļa halogenēto indolu un pats indols, izņemot 5-jodoindolu un 2-jodoindolu, veido saiti ar serīnu 260. Fakts, ka ūdeņraža saite ar leicīnu 218 liecina par efektīvu receptoru-ligandu saistīšanos, kā novērots ivermektīnam (papildu att. 2-jodoindols, tāpat kā ivermektīns, caur leicīnu 218 cieši saistās ar GluCL receptora aktīvo vietu (6. attēls un S8 papildu attēls). Mēs ierosinām, ka šī saistīšanās ir nepieciešama, lai saglabātu GluCL kompleksa atvērto poru struktūru un ka, cieši saistoties ar GluCL receptora aktīvo vietu, 5-jodoindols, 2-jodoindols, avermektīns un ivermektīns tādējādi uztur jonu kanālu atvērtu un ļauj uzņemt šķidrumu.
Indola un halogenētā indola molekulārā savienošana ar GluCL. (A) indola, (B) 4-fluorindola, (C) 7-jodoindola un (D) 5-jodoindola ligandu saistīšanās orientācijas GluCL aktīvajai vietai. Olbaltumvielu attēlo lente, un mugurkaula ūdeņraža saites ir parādītas kā dzeltenas punktētas līnijas. (A'), (B'), (C') un (D') parāda atbilstošo ligandu mijiedarbību ar apkārtējiem aminoskābju atlikumiem, un sānu ķēdes ūdeņraža saites ir norādītas ar rozā punktētām bultiņām.
Tika veikti eksperimenti, lai novērtētu 5-jodoindola toksisko ietekmi uz kāpostu un redīsu sēklu dīgtspēju. 5-jodoindolam (0,05 vai 0,1 mM) vai avermektīnam (10 μg/ml) bija neliela ietekme uz sākotnējo dīgtspēju un stādu dīgšanu vai tā nebija nekādas (7. attēls). Turklāt netika konstatēta būtiska atšķirība starp neapstrādātu kontroles un sēklu dīgtspēju, kas apstrādātas ar 5-jodoindolu vai avermektīnu. Ietekme uz mietsakņu pagarinājumu un izveidoto sānu sakņu skaitu bija nenozīmīga, lai gan 1 mM (10 reizes tā aktīvā koncentrācija) 5-jodoindols nedaudz aizkavēja sānu sakņu attīstību. Šie rezultāti liecina, ka 5-jodoindols nav toksisks augu šūnām un neietekmē augu attīstības procesus pētītajās koncentrācijās.
5-jodoindola ietekme uz sēklu dīgtspēju. B. oleracea un R. raphanistrum sēklu dīgšana, dīgšana un sānu sakņošanās uz Murashige un Skoog agara barotnes ar vai bez avermektīna vai 5-jodoindola. Dīgšana tika reģistrēta pēc 3 dienu inkubācijas 22 ° C temperatūrā.
Šajā pētījumā ziņots par vairākiem nematodes nogalināšanas gadījumiem ar indoliem. Svarīgi ir tas, ka šis ir pirmais ziņojums par jodoindola inducējošu metilēšanu (procesu, ko izraisa mazu vakuolu uzkrāšanās, kas pakāpeniski saplūst milzu vakuolos, kas galu galā noved pie membrānas plīsuma un nāves) priežu skujās, jodoindolam uzrāda ievērojamas nematicīda īpašības, kas ir līdzīgas komerciālajam nematicīdam avermīnam.
Iepriekš ziņots, ka indoliem ir vairākas signalizācijas funkcijas prokariotos un eikariotos, tostarp bioplēves inhibīcija/veidošanās, baktēriju izdzīvošana un patogenitāte 19, 32, 33, 34. Nesen halogenēto indolu, indola alkaloīdu un pussintētisko indola atvasinājumu iespējamā terapeitiskā iedarbība ir piesaistījusi plašu pētījumu interesi 35, 36, 37. Piemēram, ir pierādīts, ka halogenētie indoli iznīcina noturīgas Escherichia coli un Staphylococcus aureus šūnas37. Turklāt ir zinātniski interesanti izpētīt halogenēto indolu efektivitāti pret citām sugām, ģintīm un valstībām, un šis pētījums ir solis ceļā uz šī mērķa sasniegšanu.
Šeit mēs piedāvājam 5-jodoindola izraisītas letalitātes mehānismu C. elegans, pamatojoties uz atgriezenisku šūnu bojājumu (RCI) un metilēšanu (4.C un 5. attēls). Tūskas izmaiņas, piemēram, pietūkums un vakuolāra deģenerācija, ir RCI un metilēšanas rādītāji, kas izpaužas kā milzīgi vakuoli citoplazmā 48, 49. RCI traucē enerģijas ražošanu, samazinot ATP ražošanu, izraisot ATPāzes sūkņa atteici vai izjaucot šūnu membrānas un izraisot strauju Na+, Ca2+ un ūdens pieplūdumu50,51,52. Intracitoplazmas vakuoli rodas dzīvnieku šūnās šķidruma uzkrāšanās rezultātā citoplazmā Ca2+ un ūdens pieplūduma dēļ53. Interesanti, ka šis šūnu bojājuma mehānisms ir atgriezenisks, ja bojājums ir īslaicīgs un šūnas noteiktu laiku sāk ražot ATP, bet, ja bojājums saglabājas vai pasliktinās, šūnas iet bojā.54 Mūsu novērojumi liecina, ka ar 5-jodoindolu apstrādātas nematodes nespēj atjaunot normālu biosintēzi pēc saskares ar stresa apstākļiem.
5-jodoindola izraisītais metilēšanas fenotips B. xylophilus var būt saistīts ar joda klātbūtni un tā molekulāro sadalījumu, jo 7-jodoindolam bija mazāka inhibējošā iedarbība uz B. xylophilus nekā 5-jodoindolam (1. tabula un papildu attēls S6). Šie rezultāti daļēji saskan ar Maltas et al. (2014), kurš ziņoja, ka piridila slāpekļa daļas pārvietošana indolā no para- uz meta-pozīciju atcēla vakuolizāciju, augšanas inhibīciju un citotoksicitāti U251 šūnās, kas liecina, ka molekulas mijiedarbība ar specifisku aktīvo vietu proteīnā ir kritiska 27, 44, 45. Šajā pētījumā novērotā mijiedarbība starp indolu vai halogenētiem indoliem un GluCL receptoriem arī apstiprina šo priekšstatu, jo tika konstatēts, ka 5- un 2-jodoindols saistās ar GluCL receptoriem spēcīgāk nekā citi pārbaudītie indoli (6. attēls un papildu attēls S8). Tika konstatēts, ka jods indola otrajā vai piektajā pozīcijā saistās ar GluCL receptora leicīnu 218, izmantojot ūdeņraža saites, savukārt citi halogenētie indoli un pats indols veido vājas sānu ķēdes ūdeņraža saites ar serīnu 260 (6. attēls). Tāpēc mēs domājam, ka halogēna lokalizācijai ir svarīga loma vakuolārās deģenerācijas indukcijā, savukārt 5-jodoindola ciešā saistīšanās saglabā jonu kanālu atvērtu, tādējādi ļaujot ātru šķidruma pieplūdumu un vakuola plīsumu. Tomēr vēl ir jānosaka detalizēts 5-jodoindola darbības mehānisms.
Pirms 5-jodoindola praktiskas lietošanas jāanalizē tā toksiskā ietekme uz augiem. Mūsu sēklu dīgtspējas eksperimenti parādīja, ka pētītajās koncentrācijās 5-jodoindolam nebija negatīvas ietekmes uz sēklu dīgtspēju vai turpmākajiem attīstības procesiem (7. attēls). Tādējādi šis pētījums sniedz pamatu 5-jodoindola izmantošanai ekoloģiskajā vidē, lai kontrolētu priežu nematožu kaitīgumu priedēm.
Iepriekšējie ziņojumi ir parādījuši, ka uz indolu balstīta terapija ir potenciāla pieeja antibiotiku rezistences un vēža progresēšanas problēmas risināšanai55. Turklāt indoliem piemīt antibakteriālas, pretvēža, antioksidantu, pretiekaisuma, pretdiabēta, pretvīrusu, antiproliferatīvas un prettuberkulozes aktivitātes, un tās var kalpot par daudzsološu pamatu zāļu izstrādei56,57. Šis pētījums pirmo reizi liecina par iespējamu joda izmantošanu kā pretparazītu un prettārpu līdzekli.
Avermektīns tika atklāts pirms trīs gadu desmitiem un ieguva Nobela prēmiju 2015. gadā, un tā kā prettārpu līdzekļa lietošana joprojām aktīvi turpinās. Tomēr, ņemot vērā straujo nematožu un kukaiņu kaitēkļu rezistences attīstību pret avermektīniem, ir nepieciešama alternatīva, zemu izmaksu un videi draudzīga stratēģija, lai kontrolētu PKN infekciju priedēs. Šis pētījums arī ziņo par mehānismu, ar kuru 5-jodoindols nogalina priežu nematodes un ka 5-jodoindolam ir zema toksicitāte augu šūnām, kas paver labas izredzes tā turpmākai komerciālai izmantošanai.
Visus eksperimentus apstiprināja Yeungnam universitātes Ētikas komiteja, Kjonsana, Koreja, un metodes tika veiktas saskaņā ar Yeungnam universitātes Ētikas komitejas vadlīnijām.
Eksperimenti ar olu inkubāciju tika veikti, izmantojot noteiktas procedūras43. Lai novērtētu izšķilšanās ātrumu (HR), 1 dienu vecas pieaugušas nematodes (apmēram 100 mātītes un 100 tēviņi) tika pārvietotas uz Petri trauciņiem, kuros bija sēne, un ļāva augt 24 stundas. Pēc tam olas tika izolētas un apstrādātas ar 5-jodoindolu (0, 05 mM un 0, 1 mM) vai avermektīnu (10 μg / ml) kā suspensiju sterilā destilētā ūdenī. Šīs suspensijas (500 μl; aptuveni 100 olas) pārnesa uz 24 bedrīšu audu kultūras plāksnes iedobēm un inkubēja 22 ° C temperatūrā. L2 skaitīšana tika veikta pēc 24 stundu inkubācijas, bet tika uzskatīta par mirušu, ja šūnas nekustējās, stimulējot ar smalku platīna stiepli. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, katrs ar sešiem atkārtojumiem. Dati no abiem eksperimentiem tika apvienoti un prezentēti. HR procentuālo daļu aprēķina šādi:
Kāpuru mirstība tika novērtēta, izmantojot iepriekš izstrādātas procedūras. Nematodu olas tika savāktas un embriji tika sinhronizēti, izšķiljoties sterilā destilētā ūdenī, lai radītu L2 stadijas kāpurus. Sinhronizētos kāpurus (apmēram 500 nematodes) apstrādāja ar 5-jodoindolu (0,05 mM un 0,1 mM) vai avermektīnu (10 μg/ml) un audzēja uz B. cinerea Petri plāksnēm. Pēc 48 stundu inkubācijas 22 ° C temperatūrā nematodes tika savāktas sterilā destilētā ūdenī un pārbaudītas, vai nav L2, L3 un L4 stadijas. L3 un L4 stadiju klātbūtne liecināja par kāpuru transformāciju, savukārt L2 stadijas klātbūtne neliecināja par transformāciju. Attēli tika iegūti, izmantojot iRiS™ digitālo šūnu attēlveidošanas sistēmu. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, katrs ar sešiem atkārtojumiem. Dati no abiem eksperimentiem tika apvienoti un prezentēti.
5-jodoindola un avermektīna toksicitāte sēklām tika novērtēta, izmantojot dīgtspējas testus uz Murashige un Skoog agara plāksnēm.62 B. oleracea un R. raphanistrum sēklas vispirms vienu dienu mērcēja sterilā destilētā ūdenī, mazgāja ar 1 ml 100% nātrija šķīduma (30% nātrija šķīdums, sterilizēts 30%). hipohlorīts) 15 minūtes un piecas reizes mazgā ar 1 ml sterila ūdens. Pēc tam sterilizētās sēklas tika uzspiestas uz dīgtspējas agara plāksnēm, kas satur 0, 86 g/l (0, 2 X) Murashige un Skoog barotni un 0, 7% bakterioloģisko agaru ar vai bez 5-jodoindola vai avermektīna. Pēc tam plāksnes inkubēja 22 ° C temperatūrā, un attēli tika uzņemti pēc 3 dienu inkubācijas. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, no kuriem katrā bija seši atkārtojumi.
Izlikšanas laiks: 26.02.2025