Priežu nematode ir karantīnas migrējošs endoparazīts, kas, kā zināms, rada nopietnus ekonomiskus zaudējumus priežu mežu ekosistēmās. Šajā pētījumā tiek apskatīta halogenēto indolu nematocīdā aktivitāte pret priežu nematodēm un to darbības mehānisms. 5-jodindola un avermektīna (pozitīvā kontrole) nematocīdā aktivitāte pret priežu nematodēm bija līdzīga un augsta zemās koncentrācijās (10 μg/ml). 5-jodindols samazināja auglību, reproduktīvo aktivitāti, embrionālo un kāpuru mirstību un lokomotoro uzvedību. Ligandu molekulārā mijiedarbība ar bezmugurkaulniekiem specifiskiem glutamāta aktivētiem hlorīda kanālu receptoriem apstiprina uzskatu, ka 5-jodindols, tāpat kā avermektīns, cieši saistās ar receptora aktīvo vietu. 5-jodindols arī izraisīja dažādas fenotipiskas deformācijas nematodēs, tostarp patoloģisku orgānu sabrukšanu/saraušanos un palielinātu vakuolizāciju. Šie rezultāti liecina, ka vakuolām var būt nozīme nematodu metilēšanas mediētā nāvē. Svarīgi ir tas, ka 5-jodindols nebija toksisks abām augu sugām (kāpostiem un redīsiem). Tādējādi šis pētījums pierāda, ka jodoindola lietošana vides apstākļos var kontrolēt priežu vītes bojājumus.
Priedes koksnes nematode (Bursaphelenchus xylophilus) pieder pie priedes koksnes nematodu (PKN) grupas – migrējošām endoparazītiskām nematodēm, kas, kā zināms, rada nopietnus ekoloģiskus kaitējumus priežu mežu ekosistēmām1. Priežu vītes slimība (PKS), ko izraisa priežu koksnes nematode, kļūst par nopietnu problēmu vairākos kontinentos, tostarp Āzijā un Eiropā, un Ziemeļamerikā nematode iznīcina introducētās priežu sugas1,2. Priežu populāciju samazināšanās ir liela ekonomiska problēma, un tās globālās izplatības perspektīva rada bažas3. Visbiežāk nematode uzbrūk šādām priežu sugām: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii un Pinus radiata4. Priežu nematode ir nopietna slimība, kas var nogalināt priedes dažu nedēļu vai mēnešu laikā pēc inficēšanās. Turklāt priežu nematodu uzliesmojumi ir izplatīti dažādās ekosistēmās, tāpēc ir izveidojušās pastāvīgas infekcijas ķēdes1.
Bursaphelenchus xylophilus ir karantīnas augu parazītiska nematode, kas pieder pie Aphelenchoidea virsdzimtas un 102.5. klades. Nematode barojas ar sēnītēm un vairojas priežu koksnes audos, attīstoties četrās dažādās kāpuru stadijās: L1, L2, L3, L4 un pieaugušā īpatnī1,6. Barības trūkuma apstākļos priežu nematode pāriet specializētā kāpuru stadijā – dauerā, kas parazitē uz sava vektora – priežu mizgrauža (Monochamus alternatus) – un tiek pārnesta uz veselām priedēm. Veseliem saimniekiem nematodes ātri migrē caur augu audiem un barojas ar parenhimatozajām šūnām, kas gada laikā pēc inficēšanās izraisa vairākas paaugstinātas jutības reakcijas, priežu novīšanu un nāvi1,7,8.
Priežu nematodu bioloģiskā kontrole jau sen ir izaicinājums, un karantīnas pasākumi tiek ieviesti jau 20. gadsimtā. Pašreizējās priežu nematodu kontroles stratēģijas galvenokārt ietver ķīmisku apstrādi, tostarp koksnes fumigāciju un nematoīdu implantēšanu koku stumbros. Visbiežāk izmantotie nematoīdi ir avermektīns un avermektīna benzoāts, kas pieder pie avermektīnu dzimtas. Šīs dārgās ķīmiskās vielas ir ļoti efektīvas pret daudzām nematodu sugām un tiek uzskatītas par videi drošām9. Tomēr sagaidāms, ka atkārtota šo nematoīdu lietošana radīs selekcijas spiedienu, kas gandrīz noteikti novedīs pie rezistentu priežu nematodu parādīšanās, kā tas ir pierādīts vairākiem kukaiņu kaitēkļiem, piemēram, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella un nematodēm Trichostrongylus colubriformis un Ostertagia circumcincta, kurām pakāpeniski ir izveidojusies rezistence pret avermektīniem10,11,12. Tāpēc rezistences modeļi ir regulāri jāpēta un nematoīdi nepārtraukti jāpārbauda, lai atrastu alternatīvus, rentablus un videi draudzīgus PVD kontroles pasākumus. Pēdējās desmitgadēs vairāki autori ir ierosinājuši augu ekstraktus, ēteriskās eļļas un gaistošās vielas izmantot kā nematodu kontroles līdzekļus13,14,15,16.
Nesen mēs pierādījām indola, starpšūnu un starpķēnišķu signālmolekulas, nematocīdo aktivitāti Caenorhabditis elegans 17. Indols ir plaši izplatīts intracelulārs signāls mikrobu ekoloģijā, kontrolējot daudzas funkcijas, kas ietekmē mikrobu fizioloģiju, sporu veidošanos, plazmīdu stabilitāti, zāļu rezistenci, bioplēves veidošanos un virulenci 18, 19. Indola un tā atvasinājumu aktivitāte pret citām patogēnām nematodēm nav pētīta. Šajā pētījumā mēs pētījām 34 indolu nematocīdo aktivitāti pret priežu nematodēm un noskaidrojām spēcīgākā 5-jodinodola darbības mehānismu, izmantojot mikroskopiju, laika intervāla fotografēšanu un molekulārās dokošanas eksperimentus, un novērtējām tā toksisko ietekmi uz augiem, izmantojot sēklu dīgtspējas testu.
Iepriekš ir ziņots, ka augstas indola koncentrācijas (>1,0 mM) izraisa nematoīdus17. Pēc B. xylophilus (jauktas dzīves stadijas) apstrādes ar indolu vai 33 dažādiem indola atvasinājumiem 1 mM koncentrācijā, B. xylophilus mirstība tika mērīta, saskaitot dzīvās un mirušās nematodes kontroles un apstrādātajā grupā. Pieci indoli uzrādīja ievērojamu nematoīdu aktivitāti; neapstrādātās kontroles grupas izdzīvošana pēc 24 stundām bija 95 ± 7%. No 34 testētajiem indoliem 5-jodindols un 4-fluorindols 1 mM koncentrācijā izraisīja 100% mirstību, savukārt 5,6-difluorindigo, metilindola-7-karboksilāts un 7-jodindols izraisīja aptuveni 50% mirstību (1. tabula).
5-jodinodola ietekme uz priedes koksnes nematodes vakuolu veidošanos un metabolismu. (A) Avermektīna un 5-jodinodola ietekme uz pieaugušām tēviņu nematodēm, (B) L1 stadijas nematodes oliņas un (C) B. xylophilus metabolisms, (i) vakuolas netika novērotas 0 h laikā, apstrāde izraisīja (ii) vakuolas, (iii) vairāku vakuolu uzkrāšanos, (iv) vakuolu pietūkumu, (v) vakuolu saplūšanu un (vi) milzu vakuolu veidošanos. Sarkanās bultiņas norāda vakuolu pietūkumu, zilās bultiņas norāda vakuolu saplūšanu un melnās bultiņas norāda milzu vakuolas. Mēroga josla = 50 μm.
Turklāt šajā pētījumā tika aprakstīts arī secīgs metāna izraisītas nāves process priežu nematodēs (4.C attēls). Metanogēna nāve ir neapoptotisks šūnu nāves veids, kas saistīts ar ievērojamu citoplazmatisko vakuolu uzkrāšanos27. Priežu nematodēs novērotie morfoloģiskie defekti, šķiet, ir cieši saistīti ar metāna izraisītas nāves mehānismu. Mikroskopiskā izmeklēšana dažādos laikos parādīja, ka pēc 20 stundu ilgas 5-jodindola (0,1 mM) iedarbības izveidojās milzu vakuolas. Pēc 8 stundu apstrādes tika novērotas mikroskopiskas vakuolas, un to skaits palielinājās pēc 12 stundām. Pēc 14 stundām tika novērotas vairākas lielas vakuolas. Pēc 12–16 stundu apstrādes bija skaidri redzamas vairākas saplūdušas vakuolas, kas norāda, ka vakuolu saplūšana ir metanogēnās nāves mehānisma pamatā. Pēc 20 stundām visā tārpā tika atrastas vairākas milzu vakuolas. Šie novērojumi ir pirmais ziņojums par metozi C. elegans.
Ar 5-jodindolu apstrādātajos tārpos tika novērota arī vakuolu agregācija un plīsums (5. att.), ko apliecina tārpu locīšanās un vakuolu izdalīšanās vidē. Vakuolu bojājumi tika novēroti arī olas čaumalas membrānā, ko parasti izšķilšanās laikā neskartu saglabā L2 (2. papildattēls). Šie novērojumi apstiprina šķidruma uzkrāšanās un osmoregulācijas traucējumu, kā arī atgriezeniska šūnu bojājuma (RCI) iesaistīšanos vakuolu veidošanās un supurācijas procesā (5. att.).
Izvirzot hipotēzi par joda lomu novērotajā vakuolu veidošanā, mēs pētījām nātrija jodīda (NaI) un kālija jodīda (KI) nematocīdo aktivitāti. Tomēr koncentrācijās (0,1, 0,5 vai 1 mM) tie neietekmēja ne nematodu izdzīvošanu, ne vakuolu veidošanos (5. papildattēls), lai gan 1 mM KI bija neliela nematocīda iedarbība. No otras puses, 7-jodinolam (1 vai 2 mM), tāpat kā 5-jodinolam, bija vairākas vakuolas un strukturālas deformācijas (6. papildattēls). Abiem jodinolam bija līdzīgas fenotipiskās īpašības priežu nematodēs, savukārt NaI un KI to nedarīja. Interesanti, ka indols testētajās koncentrācijās neizraisīja vakuolu veidošanos B. xylophilus (dati nav parādīti). Tādējādi rezultāti apstiprināja, ka indola-joda komplekss ir atbildīgs par B. xylophilus vakuolizāciju un metabolismu.
Starp indoliem, kuriem tika testēta nematocīdā aktivitāte, 5-jodinolam bija visaugstākais slīdēšanas indekss - -5,89 kcal/mol, kam sekoja 7-jodinolam (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindolam (-4,33) un indolam (-4,03) (6. attēls). 5-jodinola spēcīgā ūdeņraža saite ar leicīnu 218 stabilizē tā saistīšanos, savukārt visi pārējie indola atvasinājumi saistās ar serīnu 260, izmantojot sānu ķēdes ūdeņraža saites. Starp citiem modelētiem jodinodoliem 2-jodinola saistīšanās vērtība ir -5,248 kcal/mol, kas ir saistīta ar tā galveno ūdeņraža saiti ar leicīnu 218. Citas zināmās saistīšanās ietver 3-jodinolu (-4,3 kcal/mol), 4-jodinolu (-4,0 kcal/mol) un 6-fluorindolu (-2,6 kcal/mol) (S8. papildattēls). Lielākā daļa halogenēto indolu un pats indols, izņemot 5-jodindolu un 2-jodindolu, veido saiti ar serīnu 260. Fakts, ka ūdeņraža saite ar leicīnu 218 liecina par efektīvu receptoru-ligandu saistīšanos, kā novērots ivermektīnam (7. papildattēls), apstiprina, ka 5-jodindols un 2-jodindols, tāpat kā ivermektīns, cieši saistās ar GluCL receptora aktīvo centru caur leicīnu 218 (6. att. un S8. papildattēls). Mēs ierosinām, ka šī saistīšanās ir nepieciešama, lai saglabātu GluCL kompleksa atvērto poru struktūru, un ka, cieši saistoties ar GluCL receptora aktīvo centru, 5-jodindols, 2-jodindols, avermektīns un ivermektīns tādējādi uztur jonu kanālu atvērtu un nodrošina šķidruma uzņemšanu.
Indola un halogenēta indola molekulārā piesaiste GluCL. (A) indola, (B) 4-fluorindola, (C) 7-jodindola un (D) 5-jodindola ligandu saistīšanās orientācijas ar GluCL aktīvo centru. Olbaltumvielu attēlo lente, un mugurkaula ūdeņraža saites ir parādītas kā dzeltenas punktētas līnijas. (A′), (B′), (C′) un (D′) parāda atbilstošo ligandu mijiedarbību ar apkārtējiem aminoskābju atlikumiem, un sānu ķēdes ūdeņraža saites ir norādītas ar rozā punktētām bultiņām.
Tika veikti eksperimenti, lai novērtētu 5-jodinola toksisko ietekmi uz kāpostu un redīsu sēklu dīgtspēju. 5-jodinolam (0,05 vai 0,1 mM) vai avermektīnam (10 μg/ml) bija maza vai nekāda ietekme uz sākotnējo dīgtspēju un stādiņu dīgšanu (7. attēls). Turklāt netika konstatēta būtiska atšķirība starp neapstrādātu kontroles grupu un ar 5-jodinolu vai avermektīnu apstrādātu sēklu dīgtspēju. Ietekme uz mietsakņu pagarināšanos un izveidoto sānu sakņu skaitu bija nenozīmīga, lai gan 1 mM (10 reizes lielāka par tā aktīvo koncentrāciju) 5-jodinola nedaudz aizkavēja sānu sakņu attīstību. Šie rezultāti liecina, ka 5-jodinols nav toksisks augu šūnām un neietekmē augu attīstības procesus pētītajās koncentrācijās.
5-jodindola ietekme uz sēklu dīgšanu. B. oleracea un R. raphanistrum sēklu dīgšana, asnu veidošanās un sānu sakņošanās Murašiges un Skoogas agara vidē ar vai bez avermektīna vai 5-jodindola. Dīgšana tika reģistrēta pēc 3 dienu inkubācijas 22°C temperatūrā.
Šajā pētījumā ziņots par vairākiem nematodu iznīcināšanas gadījumiem ar indoliem. Svarīgi, ka šis ir pirmais ziņojums par jodoindola izraisītu metilēšanu (procesu, ko izraisa mazu vakuolu uzkrāšanās, kas pakāpeniski saplūst milzu vakuolās, galu galā novedot pie membrānas plīsuma un nāves) priežu skujās, un jodoindolam piemīt ievērojamas nematocīdas īpašības, kas ir līdzīgas komerciālā nematocīda avermektīna īpašībām.
Iepriekš ir ziņots, ka indoli prokariotos un eikariotos veic vairākas signalizācijas funkcijas, tostarp bioplēves inhibīciju/veidošanos, baktēriju izdzīvošanu un patogenitāti19,32,33,34. Nesen plašu pētniecisko interesi ir piesaistījusi halogenētu indolu, indola alkaloīdu un daļēji sintētisku indola atvasinājumu potenciālā terapeitiskā iedarbība35,36,37. Piemēram, ir pierādīts, ka halogenēti indoli iznīcina noturīgas Escherichia coli un Staphylococcus aureus šūnas37. Turklāt ir zinātniski interesanti pētīt halogenētu indolu efektivitāti pret citām sugām, ģintīm un valstībām, un šis pētījums ir solis šī mērķa sasniegšanā.
Šeit mēs piedāvājam mehānismu 5-jodindola izraisītai mirstībai C. elegans, pamatojoties uz atgriezenisku šūnu bojājumu (RCI) un metilēšanu (4.C un 5. attēls). Tūskas izmaiņas, piemēram, pietūkums un vakuolu deģenerācija, ir RCI un metilēšanas indikatori, kas izpaužas kā milzu vakuolas citoplazmā48,49. RCI traucē enerģijas ražošanu, samazinot ATP ražošanu, izraisot ATPāzes sūkņa atteici vai izjaucot šūnu membrānas un izraisot strauju Na+, Ca2+ un ūdens pieplūdumu50,51,52. Intracitoplazmatiskas vakuolas dzīvnieku šūnās rodas šķidruma uzkrāšanās rezultātā citoplazmā Ca2+ un ūdens pieplūduma dēļ53. Interesanti, ka šis šūnu bojājumu mehānisms ir atgriezenisks, ja bojājums ir īslaicīgs un šūnas noteiktu laiku sāk ražot ATP, bet, ja bojājums saglabājas vai pasliktinās, šūnas iet bojā.54 Mūsu novērojumi liecina, ka nematodes, kas apstrādātas ar 5-jodindolu, nespēj atjaunot normālu biosintēzi pēc stresa apstākļu iedarbības.
Metilēšanas fenotips, ko B. xylophilus inducē 5-jodinodols, var būt saistīts ar joda klātbūtni un tā molekulāro sadalījumu, jo 7-jodinolam bija mazāka inhibējoša ietekme uz B. xylophilus nekā 5-jodinolam (1. tabula un S6. papildattēls). Šie rezultāti daļēji atbilst Maltese et al. (2014) pētījumiem, kuros ziņots, ka piridilgrupas slāpekļa daļas pārvietošana indolā no para-pozīcijas uz meta-pozīciju novērsa vakuolizāciju, augšanas inhibīciju un citotoksicitāti U251 šūnās, kas liecina, ka molekulas mijiedarbība ar specifisku aktīvo centru proteīnā ir kritiska27,44,45. Šajā pētījumā novērotā mijiedarbība starp indolu vai halogenētiem indoliem un GluCL receptoriem arī apstiprina šo uzskatu, jo tika konstatēts, ka 5- un 2-jodinodols saistās ar GluCL receptoriem spēcīgāk nekā citi pārbaudītie indoli (6. attēls un S8. papildattēls). Tika konstatēts, ka jods indola otrajā vai piektajā pozīcijā saistās ar GluCL receptora leicīnu 218, izmantojot ūdeņraža saites mugurkaulā, savukārt citi halogenētie indoli un pats indols veido vājas sānu ķēdes ūdeņraža saites ar serīnu 260 (6. attēls). Tāpēc mēs pieņemam, ka halogēna lokalizācijai ir svarīga loma vakuolu deģenerācijas indukcijā, savukārt 5-jodindola ciešā saistīšanās uztur jonu kanālu atvērtu, tādējādi nodrošinot ātru šķidruma pieplūdi un vakuolu plīsumu. Tomēr detalizēts 5-jodindola darbības mehānisms vēl ir jānosaka.
Pirms 5-jodinoda praktiskas lietošanas jāanalizē tā toksiskā ietekme uz augiem. Mūsu sēklu dīgšanas eksperimenti parādīja, ka 5-jodinolam nebija negatīvas ietekmes uz sēklu dīgšanu vai turpmākajiem attīstības procesiem pētītajās koncentrācijās (7. attēls). Tādējādi šis pētījums sniedz pamatu 5-jodinoda izmantošanai ekoloģiskajā vidē, lai kontrolētu priežu nematodu kaitīgumu priedēm.
Iepriekšējie ziņojumi ir parādījuši, ka uz indolu balstīta terapija ir potenciāla pieeja antibiotiku rezistences un vēža progresēšanas problēmas risināšanai55. Turklāt indoliem piemīt antibakteriāla, pretvēža, antioksidanta, pretiekaisuma, pretdiabēta, pretvīrusu, antiproliferatīva un prettuberkulozes iedarbība, un tie varētu kalpot par daudzsološu pamatu zāļu izstrādei56,57. Šis pētījums pirmo reizi liecina par joda potenciālu izmantošanu kā pretparazītu un prethelmintisku līdzekli.
Avermektīns tika atklāts pirms trim desmitgadēm un 2015. gadā ieguva Nobela prēmiju, un tā lietošana kā attārpošanas līdzeklis joprojām tiek aktīvi turpināta. Tomēr, ņemot vērā straujo nematodu un kukaiņu kaitēkļu rezistences attīstību pret avermektīniem, ir nepieciešama alternatīva, lēta un videi draudzīga stratēģija, lai kontrolētu priežu nematodes infekciju. Šajā pētījumā ziņots arī par mehānismu, ar kuru 5-jodinolam ir zema toksicitāte augu šūnām, kas paver labas perspektīvas tā komerciālai izmantošanai nākotnē.
Visus eksperimentus apstiprināja Jeungnamas Universitātes ētikas komiteja, Kjonsanā, Korejā, un metodes tika veiktas saskaņā ar Jeungnamas Universitātes ētikas komitejas vadlīnijām.
Olu inkubācijas eksperimenti tika veikti, izmantojot noteiktas procedūras43. Lai novērtētu izšķilšanās ātrumu (HR), 1 dienu vecas pieaugušas nematodes (aptuveni 100 mātītes un 100 tēviņi) tika pārvietotas uz Petri trauciņiem, kas saturēja sēnīti, un ļāva tām augt 24 stundas. Pēc tam olas tika izolētas un apstrādātas ar 5-jodindolu (0,05 mM un 0,1 mM) vai avermektīnu (10 μg/ml) kā suspensiju sterilā destilētā ūdenī. Šīs suspensijas (500 μl; aptuveni 100 olas) tika pārvietotas uz 24 iedobju audu kultūras plāksnes iedobēm un inkubētas 22 °C temperatūrā. L2 skaitīšana tika veikta pēc 24 stundu inkubācijas, bet tika uzskatītas par mirušām, ja šūnas nekustējās, stimulējot ar smalku platīna stiepli. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, katrā no tiem bija seši atkārtojumi. Dati no abiem eksperimentiem tika apvienoti un parādīti. HR procentuālā daļa tiek aprēķināta šādi:
Kāpuru mirstība tika novērtēta, izmantojot iepriekš izstrādātas procedūras. Nematodu oliņas tika savāktas, un embriji tika sinhronizēti, izšķiļoties sterilā destilētā ūdenī, lai iegūtu L2 stadijas kāpurus. Sinhronizētie kāpuri (aptuveni 500 nematodes) tika apstrādāti ar 5-jodindolu (0,05 mM un 0,1 mM) vai avermektīnu (10 μg/ml) un audzēti uz B. cinerea Petri plāksnēm. Pēc 48 stundu inkubācijas 22 °C temperatūrā nematodes tika savāktas sterilā destilētā ūdenī un pārbaudītas, vai nav L2, L3 un L4 stadiju. L3 un L4 stadiju klātbūtne norādīja uz kāpuru transformāciju, savukārt L2 stadijas klātbūtne nenorādīja uz transformāciju. Attēli tika iegūti, izmantojot iRiS™ digitālo šūnu attēlveidošanas sistēmu. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, katrs ar sešiem atkārtojumiem. Abu eksperimentu dati tika apvienoti un parādīti.
5-jodindola un avermektīna toksicitāte sēklām tika novērtēta, izmantojot dīgtspējas testus uz Murashige un Skoog agara plāksnēm.62 B. oleracea un R. raphanistrum sēklas vispirms vienu dienu iemērcēja sterilā destilētā ūdenī, mazgāja ar 1 ml 100% etanola, 15 minūtes sterilizēja ar 1 ml 50% komerciāla balinātāja (3% nātrija hipohlorīts) un piecas reizes mazgāja ar 1 ml sterila ūdens. Pēc tam sterilizētās sēklas tika uzspiestas uz dīgtspējas agara plāksnēm, kas saturēja 0,86 g/l (0,2X) Murashige un Skoog barotni un 0,7% bakterioloģisko agaru ar vai bez 5-jodindola vai avermektīna. Pēc tam plāksnes inkubēja 22 °C temperatūrā, un attēli tika uzņemti pēc 3 inkubācijas dienām. Šis eksperiments tika veikts divos posmos, katrā no tiem bija seši atkārtojumi.
Publicēšanas laiks: 2025. gada 26. februāris