Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu labākos rezultātus, iesakām izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, mēs vietni attēlojam bez stila vai JavaScript.
Fungicīdus bieži lieto koku augļu ziedēšanas laikā, un tie var apdraudēt kukaiņu apputeksnētājus. Tomēr maz zināms par to, kā apputeksnētāji, kas nav bites (piemēram, vientuļās bites, Osmia cornifrons), reaģē uz kontakta un sistēmiskiem fungicīdiem, ko parasti lieto ābelēm ziedēšanas laikā. Šī zināšanu nepilnība ierobežo normatīvos lēmumus, kas nosaka drošas fungicīdu izsmidzināšanas koncentrācijas un laiku. Mēs novērtējām divu kontakta fungicīdu (kaptāna un mankozeba) un četru starpslāņu/fitosistemas fungicīdu (ciprociklīna, miklobutanila, pirostrobīna un trifloksistrobīna) ietekmi. Ietekme uz kāpuru svara pieaugumu, izdzīvošanu, dzimumu attiecību un baktēriju daudzveidību. Novērtējums tika veikts, izmantojot hronisku perorālu bioanalīzi, kurā ziedputekšņi tika apstrādāti trīs devās, pamatojoties uz pašlaik ieteicamo devu lietošanai laukā (1X), pusi devas (0,5X) un zemu devu (0,1X). Visas mankozeba un piritizolīna devas ievērojami samazināja ķermeņa svaru un kāpuru izdzīvošanu. Pēc tam mēs sekvencējām 16S gēnu, lai raksturotu mankozeba, fungicīda, kas ir atbildīgs par augstāko mirstību, kāpuru bakteriomu. Mēs atklājām, ka baktēriju daudzveidība un daudzums bija ievērojami samazinājies kāpuriem, kas baroti ar mankozebu apstrādātiem ziedputekšņiem. Mūsu laboratorijas rezultāti liecina, ka dažu šo fungicīdu izsmidzināšana ziedēšanas laikā ir īpaši kaitīga O. cornifrons veselībai. Šī informācija ir būtiska turpmākiem apsaimniekošanas lēmumiem par augļu koku aizsardzības līdzekļu ilgtspējīgu lietošanu un kalpo par pamatu regulatīvajiem procesiem, kuru mērķis ir aizsargāt apputeksnētājus.
Vientuļā mūrbite Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) tika ievesta Amerikas Savienotajās Valstīs no Japānas 20. gs. 70. gadu beigās un 80. gadu sākumā, un kopš tā laika sugai ir bijusi nozīmīga apputeksnētāja loma pārvaldītajās ekosistēmās. Šīs bites naturalizētās populācijas ir daļa no aptuveni 50 savvaļas bišu sugām, kas papildina bites, kas apputeksnē mandeļu un ābeļu dārzus Amerikas Savienotajās Valstīs2,3. Mūrbites saskaras ar daudzām problēmām, tostarp dzīvotņu fragmentāciju, patogēniem un pesticīdiem3,4. Starp insekticīdiem fungicīdi samazina enerģijas ieguvi, barības meklēšanu5 un ķermeņa kondicionēšanu6,7. Lai gan jaunākie pētījumi liecina, ka mūrbišu veselību tieši ietekmē komensālie un ektobaktiskie mikroorganismi8,9, jo baktērijas un sēnītes var ietekmēt uzturu un imūnās atbildes, fungicīdu iedarbības ietekme uz mūrbišu mikrobu daudzveidību tiek tikai sākta pētīt.
Dažādas iedarbības fungicīdi (kontakta un sistēmiski) tiek izsmidzināti augļu dārzos pirms un ziedēšanas laikā, lai ārstētu tādas slimības kā ābeļu kraupja puve, rūgtā puve, brūnā puve un miltrasa10,11. Fungicīdi tiek uzskatīti par nekaitīgiem apputeksnētājiem, tāpēc tos iesaka dārzniekiem ziedēšanas periodā; Bišu saskare ar šiem fungicīdiem un to norīšana ir relatīvi labi zināma, jo tā ir daļa no pesticīdu reģistrācijas procesa, ko veic ASV Vides aizsardzības aģentūra un daudzas citas valsts regulatīvās aģentūras12,13,14. Tomēr fungicīdu ietekme uz citām bišu sugām ir mazāk zināma, jo tās nav obligātas saskaņā ar tirdzniecības atļauju līgumiem Amerikas Savienotajās Valstīs15. Turklāt parasti nav standartizētu protokolu atsevišķu bišu testēšanai16,17, un tādu saimju uzturēšana, kas nodrošina bites testēšanai, ir sarežģīta18. Eiropā un ASV arvien vairāk tiek veikti dažādu pārvaldītu bišu izmēģinājumi, lai pētītu pesticīdu ietekmi uz savvaļas bitēm, un nesen ir izstrādāti standartizēti protokoli O. cornifrons19.
Ragainās bites ir monocīti, un karpu kultūrās tās tiek izmantotas kā medus bišu papildinājums vai aizvietotājs. Šīs bites izšķiļas laikā no marta līdz aprīlim, priekšlaicīgi nobriedušiem tēviņiem izšķiljoties trīs līdz četras dienas pirms mātītēm. Pēc pārošanās mātīte aktīvi vāc ziedputekšņus un nektāru, lai nodrošinātu virkni perējuma šūnu cauruļveida ligzdas dobumā (dabiskā vai mākslīgā)1,20. Olas tiek dētas uz ziedputekšņiem šūnu iekšpusē; pēc tam mātīte pirms nākamās šūnas sagatavošanas uzbūvē māla sienu. Pirmā stadijas kāpuri ir ieslēgti horionā un barojas ar embrionālajiem šķidrumiem. No otrās līdz piektajai stadijai (priekškūniņai) kāpuri barojas ar ziedputekšņiem22. Kad ziedputekšņu krājumi ir pilnībā izsmelti, kāpuri veido kokonus, iekūņojas un izšķiljas kā pieauguši īpatņi tajā pašā perējuma kamerā, parasti vasaras beigās20,23. Pieaugušie īpatņi izšķiljas nākamajā pavasarī. Pieaugušo izdzīvošana ir saistīta ar neto enerģijas pieaugumu (svara pieaugumu), pamatojoties uz barības uzņemšanu. Tādējādi ziedputekšņu uzturvērtība, kā arī citi faktori, piemēram, laika apstākļi vai pesticīdu iedarbība, ir izdzīvošanas un veselības noteicošie faktori24.
Insekticīdi un fungicīdi, ko lieto pirms ziedēšanas, spēj pārvietoties auga asinsvados dažādās pakāpēs, sākot no translamināras (piemēram, spēj pārvietoties no lapu augšējās virsmas uz apakšējo virsmu, tāpat kā daži fungicīdi)25 līdz patiesi sistēmiskai iedarbībai. , kas var iekļūt vainagā no saknēm, var iekļūt ābeļu ziedu nektārā26, kur tie var nogalināt pieaugušas O. cornifrons27. Daži pesticīdi arī izskalojas ziedputekšņos, ietekmējot kukurūzas kāpuru attīstību un izraisot to bojāeju19. Citi pētījumi ir parādījuši, ka daži fungicīdi var būtiski mainīt radniecīgās sugas O. lignaria28 ligzdošanas paradumus. Turklāt laboratorijas un lauka pētījumi, kuros simulēti pesticīdu iedarbības scenāriji (tostarp fungicīdi), ir parādījuši, ka pesticīdi negatīvi ietekmē medus bišu un dažu vientuļnieku bišu fizioloģiju22, morfoloģiju29 un izdzīvošanu. Dažādi fungicīdu aerosoli, ko ziedēšanas laikā tieši lieto uz atvērtiem ziediem, var piesārņot pieaugušu īpatņu savāktos ziedputekšņus kāpuru attīstībai, un to ietekme vēl ir jāizpēta30.
Arvien vairāk tiek atzīts, ka kāpuru attīstību ietekmē ziedputekšņi un gremošanas sistēmas mikrobu kopienas. Medus bišu mikrobioms ietekmē tādus parametrus kā ķermeņa masa31, vielmaiņas izmaiņas22 un uzņēmība pret patogēniem32. Iepriekšējos pētījumos ir pētīta attīstības stadijas, barības vielu un vides ietekme uz vientuļbišu mikrobiomu. Šie pētījumi atklāja līdzības kāpuru un ziedputekšņu mikrobiomu struktūrā un daudzumā33, kā arī visizplatītākās baktēriju ģintis Pseudomonas un Delftia starp vientuļbišu sugām. Tomēr, lai gan fungicīdi ir saistīti ar stratēģijām bišu veselības aizsardzībai, fungicīdu ietekme uz kāpuru mikrobiotu tiešas perorālas iedarbības rezultātā joprojām nav izpētīta.
Šajā pētījumā tika pārbaudīta sešu bieži lietotu fungicīdu, kas Amerikas Savienotajās Valstīs reģistrēti lietošanai uz koku augļiem, reālu devu ietekme, tostarp kontakta un sistēmiskie fungicīdi, ko iekšķīgi ievadīja kukurūzas ragtārpu kodes kāpuriem no piesārņotas pārtikas. Mēs atklājām, ka kontakta un sistēmiskie fungicīdi samazināja bišu ķermeņa masas pieaugumu un palielināja mirstību, un visnopietnākā ietekme bija saistīta ar mankozebu un piritiopīdu. Pēc tam mēs salīdzinājām to kāpuru mikrobu daudzveidību, kuri tika baroti ar mankozebu apstrādātu ziedputekšņu barību, ar tiem, kuri tika baroti ar kontroles barību. Mēs apspriežam iespējamos mehānismus, kas ir mirstības pamatā, un ietekmi uz integrētām kaitēkļu un apputeksnētāju apkarošanas (IPPM)36 programmām.
Pieauguši O. cornifrons kokonos, kas ziemoja kokonos, tika iegūti no Augļu pētniecības centra Biglervilā, Pensilvānijā, un uzglabāti -3 līdz 2 °C temperatūrā (± 0,3 °C). Pirms eksperimenta (kopā 600 kokoni). 2022. gada maijā 100 O. cornifrons kokoni katru dienu tika pārvietoti plastmasas krūzītēs (50 kokoni krūzītē, DI 5 cm × 15 cm gari), un krūzīšu iekšpusē tika ievietotas salvetes, lai veicinātu atvēršanos un nodrošinātu košļājamu substrātu, samazinot stresu akmeņbitēm37. Ievietojiet divas plastmasas krūzītes ar kokoniem kukaiņu būrī (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taivāna) ar 10 ml barotavām, kas satur 50% saharozes šķīdumu, un uzglabājiet četras dienas, lai nodrošinātu aizvēršanos un pārošanos. 23 °C, relatīvais mitrums 60%, fotoperiods 10 l (zema intensitāte): 14 dienas. Ābolu ziedēšanas laikā katru rītu sešas dienas (100 dienā) divās mākslīgās ligzdās tika izlaistas 100 pārojušās mātītes un tēviņi (slazdu ligzda: platums 33, 66 × augstums 30, 48 × garums 46, 99 cm; 1. papildattēls). Novietots Pensilvānijas štata arboretumā, blakus ķiršiem (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), persikiem (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), bumbieriem (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), koronāriskajām ābelēm (Malus coronaria) un daudzām ābeļu šķirnēm (Malus coronaria, Malus), mājas ābelei 'Co-op 30′ Enterprise™, Malus ābelei 'Co-Op 31′ Winecrisp™, begonijām 'Freedom', begonijām 'Golden Delicious', begonijām 'Nova Spy'). Katra zilā plastmasas putnu būdiņa der divām koka kastēm. Katrā ligzdas kārbā bija 800 tukšas kraftpapīra caurulītes (spirālveida atvēršanas veidā, 0,8 cm iekšējais diametrs × 15 cm garums) (Jonesville Paper Tube Co., Mičigana), kas ievietotas necaurspīdīgās celofāna caurulītēs (0,7 ārējais diametrs, sk. Plastmasas aizbāžņi (T-1X aizbāžņi) nodrošina ligzdošanas vietas.
Abas ligzdu kastes bija vērstas uz austrumiem un bija pārklātas ar zaļu plastmasas dārza žogu (Everbilt modelis #889250EB12, atveres izmērs 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m), lai novērstu grauzēju un putnu piekļuvi, un tika novietotas uz augsnes virsmas blakus ligzdu kastes augsnes kastēm. Ligzdu kaste (1.a papildattēls). Kukurūzas urbja olas tika savāktas katru dienu, savācot 30 mēģenes no ligzdām un transportējot tās uz laboratoriju. Izmantojot šķēres, mēģenes galā izveidojiet iegriezumu, pēc tam izjauciet spirālveida mēģeni, lai atsegtu perējuma šūnas. Atsevišķas olas un to ziedputekšņi tika izņemti, izmantojot izliektu lāpstiņu (Microslide instrumentu komplekts, BioQuip Products Inc., Kalifornija). Olas tika inkubētas uz mitra filtrpapīra un uz 2 stundām ievietotas Petri trauciņā, pirms tās tika izmantotas mūsu eksperimentos (1.b–d papildattēls).
Laboratorijā mēs novērtējām sešu fungicīdu perorālo toksicitāti, kas tika lietoti pirms un ābeļu ziedēšanas laikā trīs koncentrācijās (0,1X, 0,5X un 1X, kur 1X ir atzīme, kas lietota uz 100 galoniem ūdens/akru. Augsta lauka deva = koncentrācija laukā). , 1. tabula). Katra koncentrācija tika atkārtota 16 reizes (n = 16). Divi kontaktfungicīdi (S1. tabula: mankozebs 2696,14 ppm un kaptāns 2875,88 ppm) un četri sistēmiski fungicīdi (S1. tabula: piritiostrobīns 250,14 ppm; trifloksistrobīns 110,06 ppm; miklobutanila azols 75,12 ppm; ciprodinils 280,845 ppm) izraisīja toksicitāti augļiem, dārzeņiem un dekoratīvajām kultūrām. Mēs homogenizējām ziedputekšņus, izmantojot dzirnaviņas, pārvietojām 0,20 g uz iedobi (24 iedobju Falcon plate) un pievienojām un sajaucām 1 μL fungicīda šķīduma, lai izveidotu piramīdveida ziedputekšņus ar 1 mm dziļām iedobēm, kurās ievietojām oliņas. Novietojiet, izmantojot mini lāpstiņu (1.c, d papildattēls). Falcon plates uzglabāja istabas temperatūrā (25 °C) un 70% relatīvajā mitrumā. Mēs tās salīdzinājām ar kontroles kāpuriem, kas baroti ar homogēnu ziedputekšņu barību, kas apstrādāta ar tīru ūdeni. Mēs reģistrējām mirstību un izmērījām kāpuru svaru katru otro dienu, līdz kāpuri sasniedza pirmskūniņu vecumu, izmantojot analītiskos svarus (Fisher Scientific, precizitāte = 0,0001 g). Visbeidzot, dzimumu attiecība tika novērtēta, atverot kokonu pēc 2,5 mēnešiem.
DNS tika ekstrahēta no veseliem O. cornifrons kāpuriem (n = 3 katrā apstrādes stāvoklī, ar mankozebu apstrādāti un neapstrādāti ziedputekšņi), un mēs veicām mikrobu daudzveidības analīzes šiem paraugiem, jo īpaši tāpēc, ka mankozebā visaugstākā mirstība tika novērota kāpuriem, kas saņēma MnZn. DNS tika amplificēta, attīrīta, izmantojot DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNS komplektu (Zymo Research, Irvine, CA), un sekvencēta (600 cikli) ar Illumina® MiSeq™, izmantojot v3 komplektu. Baktēriju 16S ribosomu RNS gēnu mērķtiecīga sekvencēšana tika veikta, izmantojot Quick-16S™ NGS bibliotēkas sagatavošanas komplektu (Zymo Research, Irvine, CA), izmantojot praimerus, kas vērsti uz 16S rRNS gēna V3-V4 reģionu. Turklāt 18S sekvencēšana tika veikta, izmantojot 10% PhiX iekļaušanu, un amplifikācija tika veikta, izmantojot praimeru pāri 18S001 un NS4.
Importējiet un apstrādājiet pārī savienotos lasījumus39, izmantojot QIIME2 cauruļvadu (v2022.11.1). Šie lasījumi tika apgriezti un apvienoti, un himēriskās sekvences tika noņemtas, izmantojot DADA2 spraudni QIIME2 (qiime dada2 trokšņu pārošana)40. 16S un 18S klašu piešķiršana tika veikta, izmantojot objektu klasifikatora spraudni Classify-sklearn un iepriekš apmācītu artefaktu silva-138-99-nb-classifier.
Visi eksperimentālie dati tika pārbaudīti attiecībā uz normalitāti (Šapiro-Vilksa tests) un dispersiju homogenitāti (Lēvena tests). Tā kā datu kopa neatbilda parametriskās analīzes pieņēmumiem un transformācija nespēja standartizēt atlikumus, mēs veicām neparametrisku divvirzienu ANOVA (Kruskal-Wallis) ar diviem faktoriem [laiks (trīs fāžu 2, 5 un 8 dienu laika punkti) un fungicīds], lai novērtētu apstrādes ietekmi uz kāpuru svaigsvaru, pēc tam tika veiktas post hoc neparametriskas pāru salīdzināšanas, izmantojot Vilkoksona testu. Mēs izmantojām vispārinātu lineāru modeli (GLM) ar Puasona sadalījumu, lai salīdzinātu fungicīdu ietekmi uz izdzīvošanu dažādās trīs fungicīdu koncentrācijās41,42. Diferenciālās pārpilnības analīzei amplikonu secības variantu (ASV) skaits tika apkopots ģints līmenī. Diferenciālās pārpilnības salīdzinājumi starp grupām, izmantojot 16S (ģints līmenis) un 18S relatīvo pārpilnību, tika veikti, izmantojot vispārinātu aditīvo modeli pozīcijai, mērogam un formai (GAMLSS) ar beta nulles piepūstu (BEZI) dzimtas sadalījumiem, kas tika modelēti makro formātā programmā Microbiome R43 (v1.1). 1). Pirms diferenciālās analīzes noņemiet mitohondriju un hloroplastu sugas. 18S atšķirīgo taksonomisko līmeņu dēļ diferenciālanalīzē tika izmantots tikai katra taksona zemākais līmenis. Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot R (v. 3.4.3., CRAN projekts) (Team 2013).
Mankozeba, piritiostrobīna un trifloksistrobīna iedarbība ievērojami samazināja ķermeņa masas pieaugumu O. cornifrons (1. att.). Šī ietekme tika konsekventi novērota visām trim novērtētajām devām (1.a–c. att.). Ciklostrobīns un miklobutanils būtiski nesamazināja kāpuru svaru.
Stublāju kāpuru vidējais svaigais svars, mērīts trīs laika punktos četru barības maisījumu pielietošanas laikā (homogēna ziedputekšņu barība + fungicīds: kontrole, 0,1X, 0,5X un 1X devas). (a) Zema deva (0,1X): pirmais laika punkts (1. diena): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, otrais laika punkts (5. diena): 22,83, DF = 0,0009; trešais laika punkts; punkts (8. diena): χ2: 28,39, DF = 6; (b) puse devas (0,5X): pirmais laika punkts (1. diena): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, otrais laika punkts (pirmā diena). ): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; trešais laika punkts (8. diena) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Vieta vai pilna deva (1X): pirmais laika punkts (1. diena) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, otrais laika punkts (5. diena): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; trešais laika punkts (8. diena): χ2: 28,39, DF = 6; neparametriskā dispersijas analīze. Stieņi apzīmē pāru salīdzinājumu vidējo vērtību ± SE (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Pie zemākās devas (0,1X) kāpuru ķermeņa masa samazinājās par 60%, lietojot trifloksistrobīnu, par 49%, lietojot mankozebu, par 48%, lietojot miklobutanilu, un par 46%, lietojot piritistrobīnu (1.a att.). Pakļaujot pusei no lauka devas (0,5X), mankozeba kāpuru ķermeņa masa samazinājās par 86%, piritiostrobīna gadījumā par 52% un trifloksistrobīna gadījumā par 50% (1.b att.). Pilna lauka deva (1X) mankozeba samazināja kāpuru svaru par 82%, piritiostrobīna gadījumā par 70% un trifloksistrobīna, miklobutanila un sangarda gadījumā par aptuveni 30% (1.c att.).
Mirstība bija visaugstākā kāpuriem, kas tika baroti ar mankozebu apstrādātiem ziedputekšņiem, kam sekoja piritiostrobīns un trifloksistrobīns. Mirstība palielinājās, palielinoties mankozeba un piritisolīna devām (2. att.; 2. tabula). Tomēr kukurūzas urbja mirstība palielinājās tikai nedaudz, palielinoties trifloksistrobīna koncentrācijai; ciprodinils un kaptāns būtiski nepalielināja mirstību salīdzinājumā ar kontroles grupu.
Tika salīdzināta urbējmusu kāpuru mirstība pēc ziedputekšņu uzņemšanas, individuāli apstrādājot tos ar sešiem dažādiem fungicīdiem. Mankozebs un pentopiramīds bija jutīgāki pret perorālu iedarbību uz kukurūzas kāpuriem (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (līnija, slīpums = 0,29, P < 0,001; slīpums = 0,24, P < 0,00)).
Vidēji visās ārstēšanas grupās 39,05 % pacientu bija sievietes un 60,95 % bija vīrieši. Kontroles grupā sieviešu īpatsvars gan zemas devas (0,1 X), gan pusdevas (0,5 X) pētījumos bija 40 %, bet lauka devas (1 X) pētījumos — 30 %. Pie 0,1 X devas starp ar ziedputekšņiem barotiem kāpuriem, kas tika ārstēti ar mankozebu un miklobutanilu, 33,33 % pieaugušo īpatņu bija mātītes, 22 % pieaugušo bija mātītes, 44 % pieaugušo kāpuru bija mātītes, 44 % pieaugušo kāpuru bija mātītes, 41 % pieaugušo kāpuru bija mātītes un kontroles grupā bija 31 % (3.a att.). Pie 0,5 reizes lielākas devas 33% pieaugušo tārpu mankozeba un piritiostrobīna grupā bija mātītes, 36% trifloksistrobīna grupā, 41% miklobutanila grupā un 46% ciprostrobīna grupā. Šis rādītājs bija 53% kaptāna grupā un 38% kontroles grupā (3.b att.). Pie 1 reizes lielākas devas 30% mankozeba grupas bija sievietes, 36% piritiostrobīna grupā, 44% trifloksistrobīna grupā, 38% miklobutanila grupā, 50% kontroles grupā bija sievietes – 38,5% (3.c att.).
Sieviešu un tēviņu urbēju procentuālā daļa pēc kāpuru stadijas fungicīda iedarbības. (a) Zema deva (0,1X). (b) Puse devas (0,5X). c) Lauka deva vai pilna deva (1X).
16S sekvences analīze parādīja, ka baktēriju grupa atšķīrās starp kāpuriem, kas baroti ar mankozebu apstrādātiem ziedputekšņiem, un kāpuriem, kas baroti ar neapstrādātiem ziedputekšņiem (4.a att.). Neapstrādātu kāpuru, kas baroti ar ziedputekšņiem, mikrobu indekss bija augstāks nekā kāpuriem, kas baroti ar mankozebu apstrādātiem ziedputekšņiem (4.b att.). Lai gan novērotā daudzveidības atšķirība starp grupām nebija statistiski nozīmīga, tā bija ievērojami zemāka nekā novērotā kāpuriem, kas baroti ar neapstrādātiem ziedputekšņiem (4.c att.). Relatīvais daudzums parādīja, ka ar kontroles ziedputekšņiem baroto kāpuru mikrobiota bija daudzveidīgāka nekā kāpuru, kas baroti ar mankozebu apstrādātiem kāpuriem (5.a att.). Aprakstošā analīze atklāja 28 ģinšu klātbūtni kontroles un mankozeba apstrādātajos paraugos (5.b att.). c Analīze, izmantojot 18S sekvencēšanu, neatklāja būtiskas atšķirības (2. papildattēls).
SAV profili, kuru pamatā ir 16S sekvences, tika salīdzināti ar Šenona bagātību un novēroto bagātību tipa līmenī. (a) Galveno koordinātu analīze (PCoA), kuras pamatā ir kopējā mikrobu kopienas struktūra neapstrādātos ar ziedputekšņiem barotos vai kontroles kāpuros (zilā krāsā) un ar mankozebu barotos kāpuros (oranžā krāsā). Katrs datu punkts apzīmē atsevišķu paraugu. PCoA tika aprēķināts, izmantojot Breja-Kērtisa attālumu no daudzfaktoru t sadalījuma. Ovāli apzīmē 80% ticamības līmeni. (b) Kastes diagramma, neapstrādāti Šenona bagātības dati (punkti) un c. Novērojamā bagātība. Kastes diagrammās ir redzamas vidējās līnijas, starpkvartiļu diapazona (IQR) un 1,5 × IQR (n = 3) rūtiņas.
Ar mankozebu apstrādātu un neapstrādātu ziedputekšņu baroto kāpuru mikrobu kopienu sastāvs. (a) Mikrobu ģinšu relatīvais daudzums kāpuros. (b) Identificēto mikrobu kopienu siltuma karte. Delftia (izredžu attiecība (OR) = 0,67, P = 0,0030) un Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Siltuma kartes rindas ir grupētas, izmantojot korelācijas attālumu un vidējo savienojamību.
Mūsu rezultāti liecina, ka kontakta (mankozebs) un sistēmisko (pirostrobīns un trifloksistrobīns) fungicīdu perorāla iedarbība, plaši lietojot ziedēšanas laikā, ievērojami samazināja kukurūzas kāpuru svara pieaugumu un palielināja mirstību. Turklāt mankozebs ievērojami samazināja mikrobioma daudzveidību un bagātību pirmskūniņu stadijā. Miklobutanils, vēl viens sistēmisks fungicīds, visās trijās devās ievērojami samazināja kāpuru ķermeņa masas pieaugumu. Šī ietekme bija redzama otrajā (5. dienā) un trešajā (8. dienā) laika punktā. Turpretī ciprodinils un kaptāns būtiski nesamazināja svara pieaugumu vai izdzīvošanu, salīdzinot ar kontroles grupu. Mūsuprāt, šis darbs ir pirmais, kurā noteikta dažādu fungicīdu lauka devu ietekme, ko lieto kukurūzas kultūru aizsardzībai, izmantojot tiešu ziedputekšņu iedarbību.
Visas fungicīdu apstrādes ievērojami samazināja ķermeņa masas pieaugumu, salīdzinot ar kontroles grupu. Mankozebam bija vislielākā ietekme uz kāpuru ķermeņa masas pieaugumu, vidēji samazinoties par 51%, kam sekoja piritiostrobīns. Tomēr citos pētījumos nav ziņots par fungicīdu lauka devu nelabvēlīgu ietekmi uz kāpuru stadijām44. Lai gan ir pierādīts, ka ditiokarbamāta biocīdiem ir zema akūta toksicitāte45, etilēnbisditiokarbamāti (EBDCS), piemēram, mankozebs, var sadalīties līdz urīnvielas etilēnsulfīdam. Ņemot vērā tā mutagēno iedarbību uz citiem dzīvniekiem, šis noārdīšanās produkts var būt atbildīgs par novēroto iedarbību46,47. Iepriekšējie pētījumi liecina, ka etilēntiourīnvielas veidošanos ietekmē tādi faktori kā paaugstināta temperatūra48, mitruma līmenis49 un produkta uzglabāšanas ilgums50. Pareizi biocīdu uzglabāšanas apstākļi var mazināt šīs blakusparādības. Turklāt Eiropas Pārtikas nekaitīguma iestāde ir paudusi bažas par piritiopīda toksicitāti, kas ir pierādīts kā kancerogēns citu dzīvnieku gremošanas sistēmai51.
Mankozeba, piritiostrobīna un trifloksistrobīna iekšķīga lietošana palielina kukurūzas svilpēja kāpuru mirstību. Turpretī miklobutanilam, ciprociklīnam un kaptānam nebija ietekmes uz mirstību. Šie rezultāti atšķiras no Ladurnera et al.52 rezultātiem, kuri parādīja, ka kaptāns ievērojami samazināja pieaugušo O. lignaria un Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae) izdzīvošanu. Turklāt ir atklāts, ka tādi fungicīdi kā kaptāns un boskalīds izraisa kāpuru mirstību52,53,54 vai maina barošanās paradumus55. Šīs izmaiņas savukārt var ietekmēt ziedputekšņu uzturvērtību un galu galā kāpuru stadijas enerģijas pieaugumu. Kontroles grupā novērotā mirstība atbilda citiem pētījumiem56,57.
Mūsu darbā novēroto tēviņiem labvēlīgo dzimumu attiecību var izskaidrot ar tādiem faktoriem kā nepietiekama pārošanās un slikti laika apstākļi ziedēšanas laikā, kā iepriekš Visenss un Bošs ieteica O. cornuta. Lai gan mūsu pētījumā mātītēm un tēviņiem bija četras dienas, lai pārotos (periods, kas parasti tiek uzskatīts par pietiekamu veiksmīgai pārošanai), mēs apzināti samazinājām gaismas intensitāti, lai mazinātu stresu. Tomēr šī modifikācija var netīši traucēt pārošanās procesu61. Turklāt bites piedzīvo vairākas nelabvēlīgu laikapstākļu dienas, tostarp lietu un zemu temperatūru (<5°C), kas var negatīvi ietekmēt arī pārošanās panākumus4,23.
Lai gan mūsu pētījums koncentrējās uz visu kāpuru mikrobiomu, mūsu rezultāti sniedz ieskatu potenciālajās attiecībās starp baktēriju kopienām, kas var būt kritiski svarīgas bišu uzturam un fungicīdu iedarbībai. Piemēram, kāpuriem, kas baroti ar mankozebu apstrādātiem ziedputekšņiem, bija ievērojami samazināta mikrobu kopienas struktūra un daudzums, salīdzinot ar kāpuriem, kas baroti ar neapstrādātiem ziedputekšņiem. Kāpuriem, kas patērēja neapstrādātus ziedputekšņus, dominējošās bija baktēriju grupas Proteobacteria un Actinobacteria, un tās pārsvarā bija aerobas vai fakultatīvi aerobas. Ir zināms, ka Delfta baktērijas, kas parasti saistītas ar vientuļnieku bišu sugām, piemīt antibiotiska aktivitāte, kas norāda uz potenciālu aizsargājošu lomu pret patogēniem. Cita baktēriju suga, Pseudomonas, bija bagātīga kāpuros, kas baroti ar neapstrādātiem ziedputekšņiem, bet ievērojami samazināta ar mankozebu apstrādātajos kāpuros. Mūsu rezultāti apstiprina iepriekšējos pētījumus, kuros Pseudomonas tika identificētas kā viena no visizplatītākajām ģintīm O. bicornis35 un citās vientuļnieku lapsenēs34. Lai gan eksperimentāli pierādījumi par Pseudomonas lomu O. cornifrons veselībā nav pētīti, ir pierādīts, ka šī baktērija veicina aizsargājošu toksīnu sintēzi vabolē Paederus fuscipes un veicina arginīna metabolismu in vitro 35, 65. Šie novērojumi liecina par potenciālu lomu vīrusu un baktēriju aizsardzībā O. cornifrons kāpuru attīstības laikā. Microbacterium ir vēl viena ģints, kas identificēta mūsu pētījumā, un par kuru ziņots, ka tā lielā skaitā ir sastopama melnās kareivja mušas kāpuros bada apstākļos66. O. cornifrons kāpuros mikrobaktērijas var veicināt zarnu mikrobioma līdzsvaru un noturību stresa apstākļos. Turklāt Rhodococcus ir atrodams O. cornifrons kāpuros un ir pazīstams ar savām detoksikācijas spējām67. Šī ģints ir atrodama arī A. florea zarnās, bet ļoti nelielā daudzumā68. Mūsu rezultāti liecina par vairāku ģenētisku variāciju klātbūtni daudzos mikrobu taksonos, kas var mainīt vielmaiņas procesus kāpuros. Tomēr ir nepieciešama labāka izpratne par O. cornifrons funkcionālo daudzveidību.
Rezumējot, rezultāti liecina, ka mankozebs, piritiostrobīns un trifloksistrobīns samazināja ķermeņa masas pieaugumu un palielināja kukurūzas svilpēja kāpuru mirstību. Lai gan pieaug bažas par fungicīdu ietekmi uz apputeksnētājiem, ir labāk jāizprot šo savienojumu atlikušo metabolītu ietekme. Šos rezultātus var iekļaut ieteikumos integrētām apputeksnētāju pārvaldības programmām, kas palīdz lauksaimniekiem izvairīties no noteiktu fungicīdu lietošanas pirms augļu koku ziedēšanas un tās laikā, izvēloties fungicīdus un mainot lietošanas laiku vai veicinot mazāk kaitīgu alternatīvu izmantošanu 36. Šī informācija ir svarīga ieteikumu izstrādei par pesticīdu lietošanu, piemēram, pielāgojot esošās smidzināšanas programmas un mainot smidzināšanas laiku, izvēloties fungicīdus, vai veicinot mazāk bīstamu alternatīvu izmantošanu. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi par fungicīdu nelabvēlīgo ietekmi uz dzimumu attiecību, barošanās paradumiem, zarnu mikrobiomu un molekulārajiem mehānismiem, kas ir pamatā kukurūzas svilpēja svara zudumam un mirstībai.
1. un 2. attēlā redzamie avota dati Nr. 1, 2 un 3 ir deponēti figshare datu repozitorijā DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 un https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. Pašreizējā pētījumā analizētās sekvences (4., 5. att.) ir pieejamas NCBI SRA repozitorijā ar piekļuves numuru PRJNA1023565.
Bosch, J. un Kemp, WP Medus bišu sugu attīstība un iedibināšana kā lauksaimniecības kultūru apputeksnētājiem: Osmia ģints piemērs. (Hymenoptera: Megachilidae) un augļu koki. bull. Ntomore. resource. 92, 3–16 (2002).
Parker, MG et al. Apputeksnēšanas prakse un alternatīvo apputeksnētāju uztvere ābolu audzētāju vidū Ņujorkā un Pensilvānijā. Atjauninājums. Lauksaimniecība. Pārtikas sistēmas. 35, 1–14 (2020).
Koch I., Lonsdorf EW, Artz DR, Pitts-Singer TL un Ricketts TH Mandeļu apputeksnēšanas ekoloģija un ekonomika, izmantojot vietējās bites. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
Lī, E., He, J. un Pārks, J.-L. Klimata pārmaiņu ietekme uz tragopānu fenoloģiju: sekas populācijas pārvaldībai. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR un Pitts-Singer, TL. Fungicīdu un adjuvantu izsmidzināšanas ietekme uz divu pārvaldītu vientuļbišu (Osmia lignaria un Megachile rotundata) ligzdošanas paradumiem. PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. et al. Zemas toksicitātes kultūraugu fungicīds (fenbukonazols) traucē tēviņu reproduktīvās kvalitātes signālus, kā rezultātā samazinās savvaļas vientuļnieku bišu pārošanās panākumi. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
Sgolastra F. et al. Neonikotinoīdu insekticīdi un ergosterola biosintēze nomāc sinerģisku fungicīdu mirstību trim bišu sugām. Kaitēkļu kontrole. Zinātne. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. un Danforth BN. Vientuļnieku lapseņu kāpuri maina baktēriju daudzveidību, ko putekšņi nodrošina stumbra ligzdojošām bitēm Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microorganism. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN un Steffan SA Ektosimbiotiskie mikroorganismi fermentētajos ziedputekšņos ir tikpat svarīgi vientuļnieku attīstībai kā paši ziedputekšņi. ekoloģija. evolūcija. 12. e8788 (2022).
Kelderer M., Manici LM, Caputo F. un Thalheimer M. Starprindu stādīšana ābeļdārzos, lai kontrolētu atkārtotas sēšanas slimības: praktisks efektivitātes pētījums, kas balstīts uz mikrobu indikatoriem. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
Martins P. L., Kravčiks T., Hodadadi F., Ahimovičs S. G. un Pīters K. A. Ābolu rūgtā puve ASV Atlantijas okeāna vidusdaļā: izraisošo sugu novērtējums un reģionālo laikapstākļu un šķirņu uzņēmības ietekme. Phytopathology 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK un Stanley DA Fungicīdi, herbicīdi un bites: esošo pētījumu un metožu sistemātisks pārskats. PLoS One 14, e0225743 (2019).
Pilling, ED un Jepson, PC EBI fungicīdu un piretroīdu insekticīdu sinerģiskā iedarbība uz medus bitēm (Apis mellifera). Pests the Science. 39, 293–297 (1993).
Mussen, EC, Lopez, JE un Peng, CY Izvēlētu fungicīdu ietekme uz medus bišu kāpuru Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae) augšanu un attīstību. Wednesday. Ntomore. 33, 1151–1154 (2004).
Van Dyke, M., Mullen, E., Wickstead, D. un McArt, S. Lēmumu pieņemšanas vadlīnijas pesticīdu lietošanai apputeksnētāju aizsardzībai koku dārzos (Kornela Universitāte, 2018).
Iwasaki, JM un Hogendoorn, K. Bišu pakļaušana nepesticīdu iedarbībai: metožu un ziņoto rezultātu apskats. Lauksaimniecība. Ekosistēma. Trešdiena. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA un Pitts-Singer TL “Piegādes veida un pesticīdu iedarbības ietekme uz Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae) kāpuru attīstību”. Wednesday. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
Kopit AM un Pitts-Singer TL Pesticīdu iedarbības ceļi uz vientuļām tukšās ligzdas bitēm. Wednesday. Ntomore. 47, 499–510 (2018).
Pan, NT et al. Jauns norīšanas bioanalīzes protokols pesticīdu toksicitātes novērtēšanai pieaugušām Japānas dārza bitēm (Osmia cornifrons). The Science. Reports 10, 9517 (2020).
Publicēšanas laiks: 2024. gada 14. maijs