Guidžou provincē nokrišņu sezonālais sadalījums ir nevienmērīgs, pavasarī un vasarā ir vairāk nokrišņu, taču rapša stādi ir uzņēmīgi pret sausuma stresu rudenī un ziemā, kas nopietni ietekmē ražu. Sinepes ir īpaša eļļas kultūra, ko galvenokārt audzē Guidžou provincē. Tai ir spēcīga sausuma tolerance, un to var audzēt kalnainos apvidos. Tā ir bagātīgs sausuma izturīgu gēnu resurss. Sausuma izturīgu gēnu atklāšana ir kritiski svarīga sinepju šķirņu uzlabošanai un dīgļplazmas resursu inovācijām. GRF saimei ir izšķiroša nozīme augu augšanā un attīstībā, kā arī reakcijā uz sausuma stresu. Pašlaik GRF gēni ir atrasti Arabidopsis 2, rīsos (Oryza sativa) 12, rapšu sēklās 13, kokvilnā (Gossypium hirsutum) 14, kviešos (Triticum aestivum) 15, pērļu prosā (Setaria italica) 16 un Brassica 17, taču nav ziņojumu par GRF gēnu atklāšanu sinepēs. Šajā pētījumā sinepju GRF saimes gēni tika identificēti genoma līmenī, un tika analizētas to fizikālās un ķīmiskās īpašības, evolūcijas attiecības, homoloģija, konservētie motīvi, gēnu struktūra, gēnu dublēšanās, cis-elementi un dīgstu stadija (četru lapu stadija). Ekspresijas modeļi sausuma stresa apstākļos tika vispusīgi analizēti, lai sniegtu zinātnisku pamatu turpmākiem pētījumiem par BjGRF gēnu potenciālo funkciju sausuma reakcijā un nodrošinātu kandidātgēnus sausumizturīgu sinepju selekcijai.
Izmantojot divas HMMER meklēšanas, Brassica juncea genomā tika identificēti trīsdesmit četri BjGRF gēni, un visi satur QLQ un WRC domēnus. Identificēto BjGRF gēnu CDS sekvences ir sniegtas 1. papildtabulā. BjGRF01–BjGRF34 ir nosaukti, pamatojoties uz to atrašanās vietu hromosomā. Šīs saimes fizikāli ķīmiskās īpašības norāda, ka aminoskābju garums ir ļoti mainīgs, sākot no 261 aminoskābes (BjGRF19) līdz 905 aminoskābēm (BjGRF28). BjGRF izoelektriskais punkts ir no 6,19 (BjGRF02) līdz 9,35 (BjGRF03), vidēji 8,33, un 88,24% BjGRF ir bāziska olbaltumviela. Paredzamais BjGRF molekulmasas diapazons ir no 29,82 kDa (BjGRF19) līdz 102,90 kDa (BjGRF28); BjGRF proteīnu nestabilitātes indekss svārstās no 51,13 (BjGRF08) līdz 78,24 (BjGRF19), visi ir lielāki par 40, kas norāda, ka taukskābju indekss svārstās no 43,65 (BjGRF01) līdz 78,78 (BjGRF22), vidējā hidrofilitāte (GRAVY) svārstās no -1,07 (BjGRF31) līdz -0,45 (BjGRF22), visiem hidrofilajiem BjGRF proteīniem ir negatīvas GRAVY vērtības, kas var būt saistīts ar atlikumu izraisītu hidrofobitātes trūkumu. Subcelulārās lokalizācijas prognoze parādīja, ka 31 BjGRF kodēts proteīns varētu būt lokalizēts kodolā, BjGRF04 varētu būt lokalizēts peroksisomās, BjGRF25 varētu būt lokalizēts citoplazmā un BjGRF28 varētu būt lokalizēts hloroplastos (1. tabula), norādot, ka BjGRF var būt lokalizēti kodolā un tiem var būt svarīga regulējoša loma kā transkripcijas faktoram.
GRF dzimtu filoģenētiskā analīze dažādās sugās var palīdzēt pētīt gēnu funkcijas. Tāpēc tika lejupielādētas 35 rapšu, 16 rāceņu, 12 rīsu, 10 prosas un 9 Arabidopsis GRF pilna garuma aminoskābju sekvences un, pamatojoties uz 34 identificētajiem BjGRF gēniem, tika konstruēts filoģenētiskais koks (1. att.). Trīs apakšdzimtās ir atšķirīgs locekļu skaits; 116 GRF TF ir sadalīti trīs dažādās apakšdzimtās (A–C grupas), kas satur attiecīgi 59 (50,86%), 34 (29,31%) un 23 (19,83)% GRF. Starp tiem 34 BjGRF dzimtas locekļi ir izkliedēti 3 apakšdzimtās: 13 locekļi A grupā (38,24%), 12 locekļi B grupā (35,29%) un 9 locekļi C grupā (26,47%). Sinepju poliploidizācijas procesā BjGRF gēnu skaits dažādās apakšdzimtās ir atšķirīgs, un var būt notikusi gēnu amplifikācija un zudums. Jāatzīmē, ka C grupā nav rīsu un prosas GRF izplatības, savukārt B grupā ir 2 rīsu GRF un 1 prosas GRF, un lielākā daļa rīsu un prosas GRF ir sagrupēti vienā zarā, kas norāda, ka BjGRF ir cieši saistīti ar divdīgļaugiem. Starp tiem vispadziļinātākie pētījumi par GRF funkciju Arabidopsis thaliana sniedz pamatu BjGRF funkcionāliem pētījumiem.
Sinepju filoģenētiskais koks, tostarp Brassica napus, Brassica napus, rīsi, prosa un Arabidopsis thaliana GRF dzimtas locekļi.
Sinepju GRF saimes atkārtoto gēnu analīze. Pelēkā līnija fonā attēlo sinhronizētu bloku sinepju genomā, sarkanā līnija attēlo BjGRF gēna segmentētu atkārtojumu pāri;
BjGRF gēna ekspresija sausuma stresa apstākļos ceturtās lapas stadijā. qRT-PCR dati ir parādīti S5. papildtabulā. Būtiskas datu atšķirības ir norādītas ar mazajiem burtiem.
Tā kā globālais klimats turpina mainīties, aktuāla pētniecības tēma ir kļuvusi par kultūraugu spēju tikt galā ar sausuma stresu un to tolerances mehānismu uzlabošanu18. Pēc sausuma mainīsies augu morfoloģiskā struktūra, gēnu ekspresija un vielmaiņas procesi, kas var izraisīt fotosintēzes pārtraukšanu un vielmaiņas traucējumus, ietekmējot kultūraugu ražu un kvalitāti19,20,21. Kad augi uztver sausuma signālus, tie ražo sekundāros kurjerus, piemēram, Ca2+ un fosfatidilinozitolu, palielina kalcija jonu koncentrāciju šūnās un aktivizē olbaltumvielu fosforilēšanās ceļa regulējošo tīklu22,23. Galīgais mērķa proteīns ir tieši iesaistīts šūnu aizsardzībā vai regulē saistītu stresa gēnu ekspresiju caur transformācijas faktoriem (TF), uzlabojot augu toleranci pret stresu24,25. Tādējādi TF ir izšķiroša loma sausuma stresa mazināšanā. Saskaņā ar sausuma stresam reaģējošo TF secību un DNS saistīšanās īpašībām TF var iedalīt dažādās ģimenēs, piemēram, GRF, ERF, MYB, WRKY un citās ģimenēs26.
GRF gēnu saime ir augiem specifisks transmisīvo transkripcijas faktoru veids, kam ir svarīga loma dažādos aspektos, piemēram, augšanā, attīstībā, signālu pārraidē un augu aizsardzības reakcijās27. Kopš pirmā GRF gēna identificēšanas O. sativa28, arvien vairāk GRF gēnu ir identificēti daudzās sugās, un ir pierādīts, ka tie ietekmē augu augšanu, attīstību un stresa reakciju8, 29, 30,31,32. Publicējot Brassica juncea genoma secību, kļuva iespējams identificēt BjGRF gēnu saimi33. Šajā pētījumā visā sinepju genomā tika identificēti 34 BjGRF gēni un, pamatojoties uz to hromosomu pozīciju, nosaukti par BjGRF01–BjGRF34. Visi no tiem satur ļoti konservētus QLQ un WRC domēnus. Fizikāli ķīmisko īpašību analīze parādīja, ka BjGRF olbaltumvielu (izņemot BjGRF28) aminoskābju skaita un molekulmasas atšķirības nebija būtiskas, kas norāda, ka BjGRF saimes locekļiem var būt līdzīgas funkcijas. Gēnu struktūras analīze parādīja, ka 64,7% BjGRF gēnu saturēja 4 eksonus, kas norāda, ka BjGRF gēna struktūra evolūcijas gaitā ir relatīvi saglabājusies, bet BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 un BjGRF29 gēnos eksonu skaits ir lielāks. Pētījumi liecina, ka eksonu vai intronu pievienošana vai dzēšana var izraisīt atšķirības gēnu struktūrā un funkcijā, tādējādi radot jaunus gēnus34,35,36. Tāpēc mēs pieņemam, ka BjGRF introns evolūcijas laikā tika zaudēts, kas var izraisīt izmaiņas gēnu funkcijā. Saskaņā ar esošajiem pētījumiem mēs arī atklājām, ka intronu skaits bija saistīts ar gēnu ekspresiju. Kad intronu skaits gēnā ir liels, gēns var ātri reaģēt uz dažādiem nelabvēlīgiem faktoriem.
Gēnu dublēšanās ir galvenais faktors genomiskajā un ģenētiskajā evolūcijā37. Saistīti pētījumi ir parādījuši, ka gēnu dublēšanās ne tikai palielina GRF gēnu skaitu, bet arī kalpo kā līdzeklis jaunu gēnu ģenerēšanai, lai palīdzētu augiem pielāgoties dažādiem nelabvēlīgiem vides apstākļiem38. Šajā pētījumā tika atrasti kopumā 48 dublēti gēnu pāri, kas visi bija segmentālas dublēšanās, norādot, ka segmentālās dublēšanās ir galvenais mehānisms gēnu skaita palielināšanai šajā saimē. Literatūrā ir ziņots, ka segmentālā dublēšanās var efektīvi veicināt GRF gēnu saimes locekļu amplifikāciju Arabidopsis un zemenēs, un nevienā no sugām netika konstatēta šīs gēnu saimes tandēma dublēšanās27,39. Šī pētījuma rezultāti saskan ar esošajiem pētījumiem par Arabidopsis thaliana un zemeņu dzimtām, kas liecina, ka GRF saime var palielināt gēnu skaitu un ģenerēt jaunus gēnus, izmantojot segmentālu dublēšanos dažādos augos.
Šajā pētījumā sinepēs tika identificēti kopumā 34 BjGRF gēni, kas tika iedalīti 3 apakšdzimtās. Šiem gēniem bija līdzīgi konservatīvi motīvi un gēnu struktūras. Kolinearitātes analīze atklāja 48 segmentu dublēšanās pārus sinepēs. BjGRF promotera reģions satur cis iedarbības elementus, kas saistīti ar gaismas reakciju, hormonālo reakciju, vides stresa reakciju, kā arī augšanu un attīstību. Sinepju dīgstu stadijā (saknes, stublāji, lapas) tika konstatēta 34 BjGRF gēnu ekspresija, un 10 BjGRF gēnu ekspresijas modelis sausuma apstākļos. Tika konstatēts, ka BjGRF gēnu ekspresijas modeļi sausuma stresa apstākļos bija līdzīgi un var būt līdzīgi. BjGRF03 un BjGRF32 gēniem var būt pozitīva regulējoša loma sausuma stresa gadījumā, savukārt BjGRF06 un BjGRF23 spēlē lomu sausuma stresa gadījumā kā miR396 mērķa gēni. Kopumā mūsu pētījums sniedz bioloģisku pamatu turpmākiem BjGRF gēnu funkcijas atklāšanai Brassicaceae augos.
Šajā eksperimentā izmantotās sinepju sēklas nodrošināja Guižou Eļļas sēklu pētniecības institūts, Guižou Lauksaimniecības zinātņu akadēmija. Atlasiet veselas sēklas un iestādiet tās augsnē (substrāts:augsne = 3:1) un pēc četru lapu stadijas savāciet saknes, stublājus un lapas. Augi tika apstrādāti ar 20% PEG 6000, lai simulētu sausumu, un lapas tika savāktas pēc 0, 3, 6, 12 un 24 stundām. Visi augu paraugi tika nekavējoties sasaldēti šķidrā slāpeklī un pēc tam uzglabāti -80°C saldētavā nākamajam testam.
Visi šajā pētījumā iegūtie vai analizētie dati ir iekļauti publicētajā rakstā un papildinformācijas failos.
Publicēšanas laiks: 2025. gada 22. janvāris