Fosforilēšana aktivizē galveno augšanas regulatoru DELLA, veicinot histona H2A saistīšanos ar hromatīnu Arabidopsis.

DELLA proteīni ir konservētiaugšanas regulatorikam ir galvenā loma augu attīstībā, reaģējot uz iekšējiem un ārējiem signāliem. Kā transkripcijas regulatori DELLA saistās ar transkripcijas faktoriem (TF) un histonu H2A, izmantojot savus GRAS domēnus, un tiek pieņemti darbā, lai iedarbotos uz promotoriem. Jaunākie pētījumi liecina, ka DELLA stabilitāti pēc translācijas regulē divi mehānismi: augu hormona izraisīta poliubikvitinācija.giberelīns, kas izraisa to strauju degradāciju un konjugāciju ar mazu ubikvitīnam līdzīgu modifikatoru (SUMO), kas palielina to uzkrāšanos. Turklāt DELLA aktivitāti dinamiski regulē divi atšķirīgi glikozilācijas mehānismi: O-fukozilācija uzlabo DELLA-TF mijiedarbību, savukārt O-saistītā N-acetilglikozamīna (O-GlcNAc) modifikācija kavē DELLA-TF mijiedarbību. Tomēr DELLA fosforilācijas loma nav skaidra, jo iepriekšējie pētījumi ir parādījuši pretrunīgus rezultātus, daži liecina, ka fosforilēšana veicina vai nomāc DELLA degradāciju, bet citi liecina, ka fosforilēšana neietekmē to stabilitāti. Šeit mēs identificējam fosforilācijas vietas GA1-3 represorā (RGA), AtDELLA, kas attīrīts no Arabidopsis thaliana ar masas spektrometriju, un parādām, ka divu RGA peptīdu fosforilēšana PolyS un PolyS / T reģionos uzlabo RGA aktivitāti, veicinot H2A saistīšanos un RGA saistību ar mērķa veicinātājiem. Proti, fosforilēšana neietekmēja RGA-TF mijiedarbību vai RGA stabilitāti. Mūsu pētījums atklāj molekulāro mehānismu, ar kura palīdzību fosforilācija izraisa DELLA aktivitāti.
Mūsu masas spektrometriskā analīze atklāja, ka gan Pep1, gan Pep2 bija ļoti fosforilēti RGA uz GA deficīta Ga1 fona. Papildus šim pētījumam fosfoproteomiskie pētījumi ir atklājuši arī Pep1 fosforilēšanos RGA, lai gan tā loma vēl nav pētīta53,54,55. Turpretim Pep2 fosforilācija iepriekš nav aprakstīta, jo šo peptīdu varēja noteikt tikai, izmantojot RGAGKG transgēnu. Lai gan m1A mutācija, kas atcēla Pep1 fosforilāciju, tikai nedaudz samazināja RGA aktivitāti plantā, tai bija aditīva iedarbība, ja to apvieno ar m2A, samazinot RGA aktivitāti (6. papildu attēls). Svarīgi, ka Pep1 fosforilācija tika ievērojami samazināta GA uzlabotajā sly1 mutantā, salīdzinot ar ga1, kas liecina, ka GA veicina RGA defosforilāciju, samazinot tā aktivitāti. Mehānisms, ar kuru GA nomāc RGA fosforilāciju, prasa turpmāku izmeklēšanu. Viena iespēja ir tāda, ka to panāk, regulējot neidentificētu proteīnkināzi. Lai gan pētījumi ir parādījuši, ka CK1 proteīna kināzes EL1 ekspresiju samazina GA rīsos41, mūsu rezultāti liecina, ka Arabidopsis EL1 homologa (AEL1-4) augstākas kārtas mutācijas nesamazina RGA fosforilāciju. Saskaņā ar mūsu rezultātiem nesen veiktajā fosfoproteomiskajā pētījumā, izmantojot Arabidopsis AEL pārmērīgi ekspresējošās līnijas un ael trīskāršo mutantu, netika identificēti DELLA proteīni kā šo kināžu substrāti56. Kad mēs sagatavojām manuskriptu, tika ziņots, ka GSK3, gēns, kas kodē GSK3 / SHAGGY līdzīgu kināzi kviešos (Triticum aestivum), var fosforilēt DELLA (Rht-B1b)57, lai gan Rht-B1b fosforilēšana ar GSK3 nav apstiprināta augā. In vitro fermentatīvās reakcijas GSK3 klātbūtnē, kam sekoja masas spektrometrijas analīze, atklāja trīs fosforilācijas vietas, kas atrodas starp Rht-B1b DELLA un GRAS domēniem (papildu attēls 3). Serīna un alanīna aizstāšana visās trīs fosforilācijas vietās izraisīja Rht-B1b aktivitātes samazināšanos transgēnos kviešos, kas atbilst mūsu konstatējumiem, ka alanīna aizstāšana Pep2 RGA samazināja RGA aktivitāti. Tomēr in vitro olbaltumvielu sadalīšanās testi vēl vairāk parādīja, ka fosforilēšana var arī stabilizēt Rht-B1b57. Tas ir pretstatā mūsu rezultātiem, kas parāda, ka alanīna aizstāšana Pep2 RGA nemaina tā stabilitāti augā. GSK3 kviešos ir brasinosteroīdiem nejutīga proteīna 2 (BIN2) ortologs Arabidopsis 57. BIN2 ir negatīvs BR signalizācijas regulators, un BR aktivizē savu signalizācijas ceļu, izraisot BIN2 degradāciju 58. Mēs parādījām, ka BR ārstēšana nesamazina RGA stabilitāti 59. attēls. kas liecina, ka maz ticams, ka BIN2 fosforilēs RGA.
Visi kvantitatīvie dati tika statistiski analizēti, izmantojot Excel, un būtiskas atšķirības tika noteiktas, izmantojot Stjudenta t-testu. Izlases lieluma iepriekšējai noteikšanai netika izmantotas statistikas metodes. No analīzes netika izslēgti dati; eksperiments nebija nejaušināts; un pētnieki bija informēti par sadalījumu eksperimenta un rezultātu novērtēšanas laikā. Paraugu izmēri ir norādīti attēlu leģendās un neapstrādātu datu failos.