Fosforilēšana aktivizē galveno augšanas regulatoru DELLA, veicinot histona H2A saistīšanos ar hromatīnu Arabidopsis .

DELLA proteīni ir konservētiaugšanas regulatorikam ir galvenā loma augu attīstībā, reaģējot uz iekšējiem un ārējiem signāliem. Kā transkripcijas regulatori, DELLA saistās ar transkripcijas faktoriem (TF) un histonu H2A caur saviem GRAS domēniem un tiek piesaistīti, lai iedarbotos uz promotoriem. Jaunākie pētījumi liecina, ka DELLA stabilitāti pēctranslācijas regulē divi mehānismi: augu hormona izraisīta poliubikvitinācijagiberelīns, kas noved pie to straujas degradācijas, un konjugācijas ar nelielu ubikvitīnam līdzīgu modifikatoru (SUMO), kas palielina to uzkrāšanos. Turklāt DELLA aktivitāti dinamiski regulē divi atšķirīgi glikozilēšanas mehānismi: O-fukozilēšana pastiprina DELLA-TF mijiedarbību, savukārt O-saistītā N-acetilglikozamīna (O-GlcNAc) modifikācija kavē DELLA-TF mijiedarbību. Tomēr DELLA fosforilēšanas loma nav skaidra, jo iepriekšējie pētījumi ir uzrādījuši pretrunīgus rezultātus, daži liecina, ka fosforilēšana veicina vai nomāc DELLA degradāciju, bet citi norāda, ka fosforilēšana neietekmē to stabilitāti. Šeit mēs identificējam fosforilēšanas vietas GA1-3 represorā (RGA), AtDELLA, kas attīrīts no Arabidopsis thaliana ar masas spektrometrijas palīdzību, un parādām, ka divu RGA peptīdu fosforilēšana PolyS un PolyS/T reģionos pastiprina RGA aktivitāti, veicinot H2A saistīšanos un RGA saistību ar mērķa promotoriem. Jāatzīmē, ka fosforilēšana neietekmēja RGA-TF mijiedarbību vai RGA stabilitāti. Mūsu pētījums atklāj molekulāro mehānismu, ar kuru fosforilēšana inducē DELLA aktivitāti.
Mūsu masas spektrometriskā analīze atklāja, ka gan Pep1, gan Pep2 bija ļoti fosforilēti RGA GA deficīta Ga1 fonā. Papildus šim pētījumam fosfoproteomikas pētījumi ir atklājuši arī Pep1 fosforilēšanu RGA, lai gan tās loma vēl nav pētīta53,54,55. Turpretī Pep2 fosforilēšana iepriekš nav aprakstīta, jo šo peptīdu varēja noteikt tikai, izmantojot RGAGKG transgēnu. Lai gan m1A mutācija, kas likvidēja Pep1 fosforilēšanu, tikai nedaudz samazināja RGA aktivitāti planta, tai bija aditīva iedarbība, apvienojumā ar m2A samazinot RGA aktivitāti (6. papildattēls). Svarīgi ir tas, ka Pep1 fosforilēšana bija ievērojami samazināta GA pastiprinātajā sly1 mutantā, salīdzinot ar ga1, kas liecina, ka GA veicina RGA defosforilēšanu, samazinot tā aktivitāti. Mehānisms, ar kuru GA nomāc RGA fosforilēšanu, ir jāturpina pētīt. Viena iespēja ir tāda, ka tas tiek panākts, regulējot neidentificētu proteīnkināzi. Lai gan pētījumi liecina, ka GA samazina CK1 proteīnkināzes EL1 ekspresiju rīsos41, mūsu rezultāti liecina, ka Arabidopsis EL1 homologa augstākas kārtas mutācijas (AEL1-4) nesamazina RGA fosforilēšanos. Saskaņā ar mūsu rezultātiem, nesen veiktā fosfoproteomikas pētījumā, izmantojot Arabidopsis AEL pārmērīgi ekspresējošas līnijas un ael trīskāršo mutantu, netika identificēti nekādi DELLA proteīni kā šo kināžu substrāti56. Kad mēs sagatavojām manuskriptu, tika ziņots, ka GSK3, gēns, kas kodē GSK3/SHAGGY līdzīgu kināzi kviešos (Triticum aestivum), var fosforilēt DELLA (Rht-B1b)57, lai gan Rht-B1b fosforilēšanās ar GSK3 nav apstiprināta planta. In vitro fermentatīvās reakcijas GSK3 klātbūtnē, kam sekoja masas spektrometrijas analīze, atklāja trīs fosforilēšanās vietas, kas atrodas starp Rht-B1b DELLA un GRAS domēniem (3. papildinājums). Serīna aizvietošana ar alanīnu visās trīs fosforilēšanas vietās izraisīja Rht-B1b aktivitātes samazināšanos transgēnajos kviešos, kas atbilst mūsu atklājumiem, ka alanīna aizvietošana Pep2 RGA samazināja RGA aktivitāti. Tomēr in vitro olbaltumvielu degradācijas testi vēl vairāk parādīja, ka fosforilēšana var stabilizēt arī Rht-B1b57. Tas ir pretrunā ar mūsu rezultātiem, kas liecina, ka alanīna aizvietošana Pep2 RGA nemaina tā stabilitāti planta. GSK3 kviešos ir brassinosteroīdiem nejutīgā proteīna 2 (BIN2) ortologs Arabidopsis 57. BIN2 ir BR signalizācijas negatīvs regulators, un BR aktivizē tā signalizācijas ceļu, izraisot BIN2 degradāciju 58. Mēs parādījām, ka BR apstrāde nesamazina RGA stabilitāti 59 vai fosforilēšanas līmeņus Arabidopsis (2. papildattēls), kas liecina, ka BIN2, visticamāk, nefosforilēs RGA.
Visi kvantitatīvie dati tika statistiski analizēti, izmantojot Excel, un nozīmīgas atšķirības tika noteiktas, izmantojot Stjudenta t-testu. Izlases lieluma iepriekšējai noteikšanai netika izmantotas statistiskās metodes. No analīzes netika izslēgti dati; eksperiments netika randomizēts; un pētnieki bija informēti par sadalījumu eksperimenta un rezultātu novērtēšanas laikā. Izlases lielumi ir norādīti attēlu aprakstos un neapstrādāto datu failos.