Dzinumu apikālās meristēmas (SAM) augšana ir būtiska stumbra arhitektūrai. Augu hormonigiberelīni(GA) ir galvenā loma augu augšanas koordinēšanā, taču to loma SAM joprojām ir slikti izprotama. Šeit mēs izstrādājām GA signalizācijas ratiometrisko biosensoru, izstrādājot DELLA proteīnu, lai nomāktu tā būtisko regulējošo funkciju GA transkripcijas reakcijā, vienlaikus saglabājot tā degradāciju pēc GA atpazīšanas. Mēs parādām, ka šis uz degradāciju balstīts biosensors precīzi reģistrē izmaiņas GA līmeņos un šūnu uztverē izstrādes laikā. Mēs izmantojām šo biosensoru, lai kartētu GA signalizācijas aktivitāti SAM. Mēs parādām, ka augsti GA signāli pārsvarā atrodas šūnās, kas atrodas starp orgānu primordijām, kas ir starpmezglu šūnu prekursori. Izmantojot funkciju palielināšanas un zaudēšanas pieejas, mēs arī parādām, ka GA regulē šūnu dalīšanas plaknes orientāciju, izveidojot starpmezglu kanonisko šūnu organizāciju, tādējādi veicinot starpmezglu specifikāciju SAM.
Dzinumu apikālā meristēma (SAM), kas atrodas dzinuma virsotnē, satur cilmes šūnu nišu, kuru darbība modulārā un iteratīvā veidā ģenerē sānu orgānus un stumbra mezglus visā auga dzīves laikā. Katra no šīm atkārtotajām vienībām jeb augu mezgliem ietver starpmezglus un sānu orgānus mezglos, kā arī paduses meristēmas lapu padusēs1. Attīstības gaitā mainās augu mezglu augšana un organizācija. Arabidopsis veģetatīvā stadijā starpmezglu augšana tiek nomākta, un rozešu lapu padusēs paliek neaktīvas paduses meristēmas. Pārejot uz ziedu fāzi, SAM kļūst par ziedkopas meristēmu, veidojot iegarenus starpmezglus un paduses pumpurus, zarus kauliņu lapu padusēs un vēlāk bezlapu ziedus2. Lai gan mēs esam panākuši ievērojamu progresu, izprotot mehānismus, kas kontrolē lapu, ziedu un zaru sākšanos, salīdzinoši maz ir zināms par to, kā rodas starpmezgli.
Izpratne par GA spatiotemporālo sadalījumu palīdzēs labāk izprast šo hormonu funkcijas dažādos audos un dažādos attīstības posmos. RGA-GFP saplūšanas degradācijas vizualizācija, kas izteikta sava promotora darbībā, sniedz svarīgu informāciju par kopējā GA līmeņa regulēšanu saknēs 15, 16. Tomēr RGA ekspresija audos atšķiras17, un to regulē GA18. Tādējādi RGA promotora diferenciālā ekspresija var izraisīt fluorescences modeli, kas novērots ar RGA-GFP, un tāpēc šī metode nav kvantitatīva. Pavisam nesen ar bioaktīvo fluoresceīnu (Fl) iezīmētais GA19, 20 atklāja GA uzkrāšanos sakņu endokorteksā un tā šūnu līmeņa regulēšanu ar GA transportēšanu. Nesen GA FRET sensors nlsGPS1 parādīja, ka GA līmenis korelē ar šūnu pagarināšanos saknēs, pavedienos un tumši audzētās hipokotilās21. Tomēr, kā mēs redzējām, GA koncentrācija nav vienīgais parametrs, kas kontrolē GA signalizācijas aktivitāti, jo tas ir atkarīgs no sarežģītiem sensoru procesiem. Šeit, pamatojoties uz mūsu izpratni par DELLA un GA signalizācijas ceļiem, mēs ziņojam par degradāciju balstīta ratiometriskā biosensora izstrādi un raksturojumu GA signalizācijai. Lai izstrādātu šo kvantitatīvo biosensoru, mēs izmantojām mutantu GA jutīgu RGA, kas tika sakausēts ar fluorescējošu proteīnu un visuresoši ekspresēts audos, kā arī pret GA nejutīgu fluorescējošu proteīnu. Mēs parādām, ka mutantu RGA proteīnu saplūšana netraucē endogēno GA signālu pārraidi, kad tās ir visuresošas, un ka šis biosensors var kvantitatīvi noteikt signalizācijas aktivitāti, kas rodas gan GA ievades, gan GA signāla apstrādes rezultātā ar sensora aparātu ar augstu spatiotemporālo izšķirtspēju. Mēs izmantojām šo biosensoru, lai kartētu GA signalizācijas aktivitātes spatiotemporālo sadalījumu un kvantitatīvi noteiktu, kā GA regulē šūnu uzvedību SAM epidermā. Mēs parādām, ka GA regulē SAM šūnu dalīšanas plaknes orientāciju, kas atrodas starp orgānu primordijām, tādējādi definējot starpmezgla kanonisko šūnu organizāciju.
Visbeidzot, mēs jautājām, vai qmRGA varētu ziņot par endogēnā GA līmeņa izmaiņām, izmantojot augošas hipokotilas. Mēs iepriekš parādījām, ka nitrāts stimulē augšanu, palielinot GA sintēzi un, savukārt, DELLA34 noārdīšanos. Attiecīgi mēs novērojām, ka hipokotila garums pUBQ10::qmRGA stādos, kas audzēti ar bagātīgu nitrātu piegādi (10 mM NO3-), bija ievērojami garāks nekā stādiem, kas audzēti nitrātu deficīta apstākļos (papildu attēls 6a). Atbilstoši augšanas reakcijai GA signāli bija augstāki sējeņos, kas audzēti 10 mM NO3- apstākļos, nekā stādiem, kas audzēti bez nitrāta (papildu 6.b, c attēls). Tādējādi qmRGA ļauj arī uzraudzīt izmaiņas GA signalizācijā, ko izraisa endogēnas GA koncentrācijas izmaiņas.
Lai saprastu, vai qmRGA noteiktā GA signalizācijas aktivitāte ir atkarīga no GA koncentrācijas un GA uztveres, kā paredzēts, pamatojoties uz sensora dizainu, mēs analizējām trīs GID1 receptoru ekspresiju veģetatīvos un reproduktīvos audos. Stādiem GID1-GUS reportieru līnija parādīja, ka GID1a un c bija izteikti izteikti dīgļlapās (3.a–c att.). Turklāt visi trīs receptori tika izteikti lapās, sānu sakņu primordijās, sakņu galos (izņemot GID1b saknes vāciņu) un asinsvadu sistēmā (3.a–c att.). Ziedkopā SAM mēs atklājām GUS signālus tikai GID1b un 1c (papildu 7.a–c attēls). In situ hibridizācija apstiprināja šos ekspresijas modeļus un vēl vairāk parādīja, ka GID1c vienmērīgi tika izteikts zemā SAM līmenī, savukārt GID1b uzrādīja augstāku ekspresiju SAM perifērijā (papildu attēls 7d–l). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translācijas saplūšana atklāja arī pakāpenisku GID1b ekspresijas diapazonu, sākot no zemas ekspresijas vai tās neesamības SAM centrā līdz augstai ekspresijai pie orgānu robežām (papildu 7. att.). Tādējādi GID1 receptori nav vienmērīgi sadalīti audos un audos. Turpmākajos eksperimentos mēs arī novērojām, ka pārmērīga GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ekspresija palielināja qmRGA jutību hipokotilās pret ārēju GA lietošanu (3.d, e att.). Turpretim fluorescence, ko mēra ar qd17mRGA hipokotilā, nebija jutīga pret GA3 ārstēšanu (3.f, g att.). Abos testos stādus apstrādāja ar augstu GA koncentrāciju (100 μM GA3), lai novērtētu sensora ātro uzvedību, kur tika pastiprināta vai zaudēta spēja saistīties ar GID1 receptoru. Kopā šie rezultāti apstiprina, ka qmRGA biosensors veic kombinētu funkciju kā GA un GA sensors, un liecina, ka GID1 receptora diferenciālā ekspresija var būtiski modulēt sensora emisijas spēju.
Līdz šim GA signālu sadalījums SAM joprojām ir neskaidrs. Tāpēc mēs izmantojām qmRGA ekspresējošus augus un pCLV3::mCherry-NLS cilmes šūnu reportieri35, lai aprēķinātu augstas izšķirtspējas GA signalizācijas aktivitātes kvantitatīvās kartes, koncentrējoties uz L1 slāni (epidermu; 4.a, b att., skatiet Metodes un papildu metodes), jo L3 augšanas kontrolē ir galvenā loma. Šeit pCLV3 :: mCherry-NLS izteiksme nodrošināja fiksētu ģeometrisku atskaites punktu GA signalizācijas aktivitātes spatiotemporal sadalījuma analīzei37. Lai gan GA tiek uzskatīta par būtisku sānu orgānu attīstībai4, mēs novērojām, ka GA signāli bija zemi ziedu primordiumā (P), sākot no P3 stadijas (4.a, b att.), savukārt jauniem P1 un P2 primordiumiem bija mērena aktivitāte, kas ir līdzīga centrālajā reģionā (4.a, b att.). Augstāka GA signalizācijas aktivitāte tika konstatēta orgānu pirmatnējības robežās, sākot no P1/P2 (robežas malās) un sasniedzot maksimumu pie P4, kā arī visās perifērā reģiona šūnās, kas atrodas starp primordiju (4.a, b un 8.a, b papildu att.). Šī augstākā GA signalizācijas aktivitāte tika novērota ne tikai epidermā, bet arī L2 un augšējos L3 slāņos (papildu 8.b attēls). Arī GA signālu modelis, kas tika atklāts SAM, izmantojot qmRGA, laika gaitā nemainījās (papildu 8.c–f, k attēls). Lai gan qd17mRGA konstrukcija tika sistemātiski pazemināta T3 augu SAM no piecām neatkarīgām līnijām, kuras mēs detalizēti raksturojām, mēs varējām analizēt fluorescences modeļus, kas iegūti ar pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstrukciju (papildu attēls 8g – j, l). Šajā kontroles līnijā SAM tika konstatētas tikai nelielas fluorescences attiecības izmaiņas, bet SAM centrā mēs novērojām skaidru un negaidītu VENUS samazināšanos, kas saistīta ar TagBFP. Tas apstiprina, ka qmRGA novērotais signalizācijas modelis atspoguļo no GA atkarīgo mRGA-VENUS degradāciju, bet arī parāda, ka qmRGA var pārvērtēt GA signalizācijas aktivitāti meristēmas centrā. Rezumējot, mūsu rezultāti atklāj GA signalizācijas modeli, kas galvenokārt atspoguļo primordia izplatību. Šāds starpprimordiālā reģiona (IPR) sadalījums ir saistīts ar pakāpenisku augstas GA signalizācijas aktivitātes izveidošanos starp attīstošo pirmatnējo reģionu un centrālo reģionu, bet tajā pašā laikā GA signalizācijas aktivitāte pirmatnējā daļā samazinās (4.c, d att.).
GID1b un GID1c receptoru sadalījums (skatīt iepriekš) liecina, ka GA receptoru diferenciālā ekspresija palīdz veidot GA signalizācijas aktivitātes modeli SAM. Mēs domājām, vai varētu būt saistīta GA diferenciālā uzkrāšanās. Lai izpētītu šo iespēju, mēs izmantojām nlsGPS1 GA FRET sensoru21. Palielināts aktivizācijas biežums tika konstatēts nlsGPS1 SAM, kas 100 minūtes apstrādāts ar 10 μM GA4+7 (papildu attēls 9a–e), norādot, ka nlsGPS1 reaģē uz GA koncentrācijas izmaiņām SAM, tāpat kā saknēs21. NlsGPS1 aktivizācijas frekvences telpiskais sadalījums atklāja salīdzinoši zemus GA līmeņus SAM ārējos slāņos, bet parādīja, ka tie bija paaugstināti SAM centrā un pie robežām (4.e attēls un papildu attēls 9a, c). Tas liek domāt, ka GA tiek izplatīts arī SAM ar telpisko modeli, kas ir salīdzināms ar qmRGA atklāto. Kā papildu pieeju mēs arī apstrādājām SAM ar fluorescējošu GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) vai Fl tikai kā negatīvu kontroli. Fl signāls tika izplatīts visā SAM, ieskaitot centrālo reģionu un primordium, lai gan ar zemāku intensitāti (4.j attēls un papildu attēls 10d). Turpretim visi trīs GA-Fl uzkrājās īpaši pirmatnējās robežās un dažādās pakāpēs pārējā IPR daļā, GA7-Fl uzkrājoties IPR lielākajā domēnā (4.k attēls un papildu 10.a, b attēls). Fluorescences intensitātes kvantitatīva noteikšana atklāja, ka IPR un ne-IPR intensitātes attiecība bija augstāka ar GA-Fl apstrādātiem SAM, salīdzinot ar ar Fl apstrādātiem SAM (4.l attēls un papildu 10.c attēls). Kopā šie rezultāti liecina, ka GA ir augstākā koncentrācijā IPR šūnās, kas atrodas vistuvāk orgānu robežai. Tas liek domāt, ka SAM GA signalizācijas aktivitātes modelis izriet gan no GA receptoru atšķirīgās ekspresijas, gan no GA atšķirīgas uzkrāšanās IPR šūnās netālu no orgānu robežām. Tādējādi mūsu analīze atklāja negaidītu GA signalizācijas spatiotemporālu modeli ar zemāku aktivitāti SAM centrā un pirmatnējā daļā un augstāku aktivitāti IPR perifērajā reģionā.
Lai saprastu diferenciālās GA signalizācijas aktivitātes lomu SAM, mēs analizējām korelāciju starp GA signalizācijas aktivitāti, šūnu paplašināšanos un šūnu dalīšanos, izmantojot SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS reāllaika laika nobīdes attēlveidošanu. Ņemot vērā GA lomu augšanas regulēšanā, bija sagaidāma pozitīva korelācija ar šūnu izplešanās parametriem. Tāpēc mēs vispirms salīdzinājām GA signalizācijas aktivitātes kartes ar šūnu virsmas augšanas ātruma kartēm (kā starpnieks šūnu izplešanās stiprumam konkrētai šūnai un meitas šūnām dalīšanās laikā) un ar augšanas anizotropijas kartēm, kas mēra šūnu izplešanās virzienu (šeit tiek izmantotas arī konkrētai šūnai un meitas šūnām dalīšanās laikā; 5.a,b att. un papildinājumus sk.). Mūsu SAM šūnu virsmas augšanas ātruma kartes atbilst iepriekšējiem novērojumiem38, 39, ar minimālu augšanas ātrumu pie robežas un maksimālo augšanas ātrumu jaunattīstības ziedos (5.a att.). Galveno komponentu analīze (PCA) parādīja, ka GA signalizācijas aktivitāte bija negatīvi korelēta ar šūnu virsmas augšanas intensitāti (5.c attēls). Mēs arī parādījām, ka galvenās variācijas asis, ieskaitot GA signālu ievadi un augšanas intensitāti, bija ortogonālas virzienam, ko noteica augsta CLV3 ekspresija, apstiprinot šūnu izslēgšanu no SAM centra atlikušajās analīzēs. Spīrmena korelācijas analīze apstiprināja PCA rezultātus (5.d attēls), norādot, ka augstāki GA signāli IPR neizraisīja lielāku šūnu izplešanos. Tomēr korelācijas analīze atklāja nelielu pozitīvu korelāciju starp GA signalizācijas aktivitāti un augšanas anizotropiju (5.c, d attēls), kas liecina, ka augstāka GA signalizācija IPR ietekmē šūnu augšanas virzienu un, iespējams, šūnu dalīšanās plaknes stāvokli.
a, b Vidējās virsmas augšanas (a) un augšanas anizotropijas (b) siltuma kartes SAM vidēji septiņiem neatkarīgiem augiem (izmanto attiecīgi kā šūnu izplešanās stipruma un virziena tuvinātājus). c PCA analīze ietvēra šādus mainīgos: GA signālu, virsmas augšanas intensitāti, virsmas augšanas anizotropiju un CLV3 ekspresiju. PCA komponents 1 galvenokārt bija negatīvi korelēts ar virsmas augšanas intensitāti un pozitīvi korelēja ar GA signālu. PCA komponents 2 galvenokārt bija pozitīvi korelēts ar virsmas augšanas anizotropiju un negatīvi korelēja ar CLV3 ekspresiju. Procenti ir katra komponenta izskaidrotās variācijas. d Spīrmena korelācijas analīze starp GA signālu, virsmas augšanas intensitāti un virsmas augšanas anizotropiju audu mērogā, izņemot CZ. Labajā pusē esošais skaitlis ir Spīrmena rho vērtība starp diviem mainīgajiem. Zvaigznītes norāda gadījumus, kad korelācija/negatīva korelācija ir ļoti nozīmīga. e Col-0 SAM L1 šūnu 3D vizualizācija ar konfokālo mikroskopiju. Jaunās šūnu sienas, kas veidojas SAM (bet ne primordijā) pēc 10 stundām, ir iekrāsotas atbilstoši to leņķa vērtībām. Krāsu josla ir parādīta apakšējā labajā stūrī. Ielaidums parāda atbilstošo 3D attēlu 0 h. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. f Box diagrammas parāda šūnu dalīšanās ātrumu IPR un ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 neatkarīgi augi). Viduslīnija parāda mediānu, un lodziņa robežas norāda 25. un 75. procentili. Ūsas norāda minimālās un maksimālās vērtības, kas noteiktas ar R programmatūru. P vērtības tika iegūtas, izmantojot Velča divpusējo t-testu. g, h Shematiska diagramma, kas parāda (g) kā izmērīt jaunās šūnas sienas (fuksīna) leņķi attiecībā pret radiālo virzienu no SAM centra (balta punktēta līnija) (tiek ņemtas vērā tikai akūtā leņķa vērtības, ti, 0–90°), un (h) riņķa/sānu un radiālo virzienu meristēmā. i Šūnu dalīšanās plaknes orientācijas frekvences histogrammas SAM (tumši zilā krāsā), IPR (vidēji zilā krāsā) un ne-IPR (gaiši zilā krāsā). P vērtības tika iegūtas ar divu virzienu Kolmogorova-Smirnova testu. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. j IPR šūnu dalīšanās plaknes orientācijas frekvences histogrammas ap P3 (gaiši zaļa), P4 (vidēji zaļa) un P5 (tumši zaļa). P vērtības tika iegūtas ar divu virzienu Kolmogorova-Smirnova testu. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.
Tāpēc mēs tālāk pētījām korelāciju starp GA signalizāciju un šūnu dalīšanās aktivitāti, nosakot jaunizveidotās šūnu sienas testa laikā (5.e attēls). Šī pieeja ļāva mums izmērīt šūnu dalīšanās biežumu un virzienu. Pārsteidzoši, mēs atklājām, ka šūnu dalīšanās biežums IPR un pārējā SAM (bez IPR, 5.f att.) bija līdzīgs, norādot, ka atšķirības GA signalizācijā starp IPR un ne-IPR šūnām būtiski neietekmē šūnu dalīšanos. Tas un pozitīvā korelācija starp GA signalizāciju un augšanas anizotropiju lika mums apsvērt, vai GA signalizācijas aktivitāte varētu ietekmēt šūnu dalīšanās plaknes orientāciju. Mēs izmērījām jaunās šūnas sienas orientāciju kā akūtu leņķi attiecībā pret radiālo asi, kas savieno meristēmas centru un jaunās šūnas sienas centru (5.e-i att.) un novērojām skaidru tendenci šūnām dalīties leņķos, kas ir tuvu 90 ° attiecībā pret radiālo asi, ar visaugstākajām frekvencēm, kas novērotas pie 70–80 ° un 23 0,2 0,6 % (230–6%). (5e,i att.), kas atbilst šūnu dalījumiem apkārtmērā/šķērsvirzienā (5.h att.). Lai pārbaudītu GA signālu ieguldījumu šajā šūnu dalīšanās uzvedībā, mēs analizējām šūnu dalīšanās parametrus IPR un ne-IPR atsevišķi (5.i attēls). Mēs novērojām, ka sadalījuma leņķa sadalījums IPR šūnās atšķīrās no ne-IPR šūnām vai šūnām visā SAM, un IPR šūnām bija lielāks sānu / apļveida šūnu dalīšanās īpatsvars, ti, 70–80 ° un 80–90 ° (attiecīgi 33, 86% un 30, 71%, atbilstošās proporcijas) (att. Tādējādi mūsu novērojumi atklāja saistību starp augstu GA signalizāciju un šūnu dalīšanās plaknes orientāciju tuvu apkārtmēra virzienam, līdzīgi kā korelācija starp GA signalizācijas aktivitāti un augšanas anizotropiju (5.c, d. att.). Lai vēl vairāk noskaidrotu šīs asociācijas telpisko saglabāšanos, mēs izmērījām dalījuma plaknes orientāciju IPR šūnās, kas ieskauj primordium, sākot no P3, jo visaugstākā GA signalizācijas aktivitāte tika konstatēta šajā reģionā, sākot no P4 (4. att.). IPR dalīšanās leņķi ap P3 un P4 neuzrādīja statistiski nozīmīgas atšķirības, lai gan IPR ap P4 tika novērots palielināts sānu šūnu dalīšanās biežums (5.j attēls). Tomēr IPR šūnās ap P5 atšķirība šūnu dalīšanās plaknes orientācijā kļuva statistiski nozīmīga, strauji palielinoties šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežumam (5.j att.). Kopā šie rezultāti liecina, ka GA signalizācija var kontrolēt šūnu dalīšanās orientāciju SAM, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem 40, 41, ka augsta GA signalizācija var izraisīt šūnu dalīšanās sānu orientāciju IPR.
Tiek prognozēts, ka IPR šūnas netiks iekļautas primordijās, bet gan starpmezglos 2, 42, 43. Šūnu dalījumu šķērseniskā orientācija IPR var izraisīt epidermas šūnu paralēlu garenisko rindu tipisku organizāciju starpmezglos. Mūsu iepriekš aprakstītie novērojumi liecina, ka GA signalizācijai, iespējams, ir nozīme šajā procesā, regulējot šūnu dalīšanās virzienu.
Vairāku DELLA gēnu funkciju zudums izraisa konstitutīvu GA reakciju, un šīs hipotēzes pārbaudei var izmantot della mutantus44. Vispirms mēs analizējām piecu DELLA gēnu ekspresijas modeļus SAM. GUS līnijas45 transkripcijas saplūšana atklāja, ka GAI, RGA, RGL1 un RGL2 (daudz mazākā mērā) tika izteikti SAM (papildu 11.a–d attēls). In situ hibridizācija arī parādīja, ka GAI mRNS uzkrājas īpaši pirmatnējos un jaunattīstības ziedos (papildu 11.e attēls). RGL1 un RGL3 mRNS tika konstatētas visā SAM nojumē un vecākos ziedos, turpretim RGL2 mRNS bija daudz vairāk pierobežas reģionā (papildu attēls 11.f–h). pRGL3::RGL3-GFP SAM konfokālā attēlveidošana apstiprināja ekspresiju, kas novērota ar in situ hibridizāciju, un parādīja, ka RGL3 proteīns uzkrājas SAM centrālajā daļā (papildu attēls 11i). Izmantojot pRGA::GFP-RGA līniju, mēs arī atklājām, ka RGA proteīns uzkrājas SAM, bet tā daudzums samazinās pie robežas, sākot no P4 (papildu attēls 11j). Proti, RGL3 un RGA ekspresijas modeļi atbilst augstākai GA signalizācijas aktivitātei IPR, kā to atklāj qmRGA (4. att.). Turklāt šie dati norāda, ka visi DELLA ir izteikti SAM un ka to izteiksme kopumā aptver visu SAM.
Tālāk mēs analizējām šūnu dalīšanās parametrus savvaļas tipa SAM (Ler, kontrole) un gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globālajos) mutantos (6.a, b att.). Interesanti, ka della globālajā mutantā SAM novērojām statistiski nozīmīgu šūnu dalīšanās leņķa frekvenču sadalījuma nobīdi salīdzinājumā ar savvaļas tipu (6.c att.). Šīs della globālā mutanta izmaiņas bija saistītas ar 80–90° leņķu (34,71% pret 24,55%) un mazākā mērā 70–80° leņķu (23,78% pret 20,18%) biežuma palielināšanos, ti, kas atbilst šķērsvirziena šūnu dalījumiem (6.c att.). Nešķērsvirziena dalījumu biežums (0–60°) arī bija mazāks della globālajam mutantam (6.c att.). Šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežums bija ievērojami palielināts della globālā mutanta SAM (6.b att.). Šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežums IPR bija arī augstāks della globālajam mutantam, salīdzinot ar savvaļas tipu (6.d attēls). Ārpus IPR reģiona savvaļas tipam bija vienmērīgāks šūnu dalīšanās leņķu sadalījums, savukārt della globālais mutants deva priekšroku tangenciālajam dalījumam, piemēram, IPR (6.e attēls). Mēs arī kvantitatīvi noteicām šūnu dalīšanās orientāciju ga2 oksidāzes (ga2ox) pieckāršu mutantu (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 un ga2ox6-2) SAM, kas ir GA neaktīvs mutanta fons, kurā uzkrājas GA. Atbilstoši GA līmeņa pieaugumam pieckāršā ga2ox mutanta ziedkopas SAM bija lielāka nekā Col-0 (papildu 12.a, b att.), un, salīdzinot ar Col-0, pieckāršā ga2ox SAM uzrādīja izteikti atšķirīgu šūnu dalīšanās leņķu sadalījumu, leņķa frekvencei palielinoties no 50°, ti, atkal daloties 900°. (Papildu 12.a–c att.). Tādējādi mēs parādām, ka konstitutīva GA signālu aktivizēšana un GA uzkrāšanās izraisa sānu šūnu dalīšanos IPR un pārējā SAM.
a, b PI iekrāsotā Ler (a) un globālā della mutanta (b) SAM L1 slāņa 3D vizualizācija, izmantojot konfokālo mikroskopiju. Jaunas šūnu sienas, kas veidojas SAM (bet ne primordijā) 10 stundu laikā, tiek parādītas un iekrāsotas atbilstoši to leņķa vērtībām. Ielaidums parāda SAM pulksten 0. Krāsu josla tiek parādīta apakšējā labajā stūrī. Bultiņa (b) norāda uz saskaņotu šūnu failu piemēru globālajā della mutantā. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. ce šūnu dalīšanās plaknes orientāciju frekvenču sadalījuma salīdzinājums visā SAM (d), IPR (e) un ne-IPR (f) starp Ler un globālo della. P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusēju Kolmogorova-Smirnova testu. f, g Col-0 (i) un pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgēno augu PI krāsotu SAM konfokālo attēlu 3D vizualizācija. Paneļos (a, b) ir redzamas jaunas šūnu sienas (bet ne primordijas), kas SAM veidojas 10 stundu laikā. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. h–j Šūnu dalīšanās plaknes orientāciju frekvenču sadalījuma salīdzinājums, kas atrodas visā SAM (h), IPR (i) un ne-IPR (j) starp Col-0 un pCUC2::gai-1-VENUS augiem. P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusējo Kolmogorova – Smirnova testu.
Pēc tam mēs pārbaudījām GA signalizācijas inhibēšanas ietekmi īpaši IPR. Šim nolūkam mēs izmantojām dīgļlapu kausa 2 (CUC2) promotoru, lai vadītu dominējošā negatīvā gai-1 proteīna ekspresiju, kas sapludināts ar VENUS (līnijā pCUC2::gai-1-VENUS). Savvaļas tipa SAM CUC2 promotors veicina vairuma IPR ekspresiju SAM, ieskaitot robežas šūnas, sākot no P4, un līdzīga specifiska ekspresija tika novērota pCUC2::gai-1-VENUS augos (skatīt zemāk). Šūnu dalīšanās leņķu sadalījums pa SAM vai IPR pCUC2::gai-1-VENUS augiem būtiski neatšķīrās no savvaļas tipa, lai gan negaidīti atklājām, ka šūnas bez IPR šajos augos dalījās ar lielāku frekvenci 80–90° (6.f–j att.).
Ir ierosināts, ka šūnu dalīšanās virziens ir atkarīgs no SAM ģeometrijas, jo īpaši no stiepes sprieguma, ko rada audu izliekums46. Tāpēc mēs jautājām, vai della globālajā mutantā un pCUC2 :: gai-1-VENUS augos ir mainīta SAM forma. Kā ziņots iepriekš12, della globālā mutanta SAM izmērs bija lielāks nekā savvaļas tipa (papildu 13.a, b, d attēls). CLV3 un STM RNS in situ hibridizācija apstiprināja meristēmu paplašināšanos della mutantos un vēl vairāk parādīja cilmes šūnu nišas sānu paplašināšanos (papildu 13.e, f, h, i attēls). Tomēr SAM izliekums bija līdzīgs abos genotipos (papildu attēls 13k, m, n, p). Mēs novērojām līdzīgu gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della četrkāršā mutanta izmēra palielināšanos bez izliekuma izmaiņām salīdzinājumā ar savvaļas tipu (papildu attēls 13c, d, g, j, l, o, p). Šūnu dalīšanās orientācijas biežums tika ietekmēts arī della četrkāršajā mutantā, bet mazākā mērā nekā della monolītajā mutantā (papildu 12.d–f attēls). Šis devas efekts, kā arī ietekmes uz izliekumu trūkums liecina, ka atlikušā RGL3 aktivitāte Della četrkāršajā mutantā ierobežo izmaiņas šūnu dalīšanās orientācijā, ko izraisa DELLA aktivitātes zudums, un ka izmaiņas sānu šūnu dalījumos notiek, reaģējot uz izmaiņām GA signalizācijas aktivitātē, nevis uz izmaiņām SAM ģeometrijā. Kā aprakstīts iepriekš, CUC2 promotors virza IPR ekspresiju SAM, sākot ar P4 (papildu attēls 14a, b), un turpretim pCUC2::gai-1-VENUS SAM bija samazināts izmērs, bet lielāks izliekums (papildu 14.c–h attēls). Šīs izmaiņas pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfoloģijā var izraisīt atšķirīgu mehānisko spriegumu sadalījumu salīdzinājumā ar savvaļas tipu, kurā lieli apkārtmēra spriegumi sākas īsākā attālumā no SAM centra47. Alternatīvi, izmaiņas pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morfoloģijā var izraisīt izmaiņas reģionālajās mehāniskajās īpašībās, ko izraisa transgēna ekspresija48. Abos gadījumos tas varētu daļēji kompensēt GA signālu izmaiņu ietekmi, palielinot iespējamību, ka šūnas sadalīsies apļveida / šķērsvirziena orientācijā, izskaidrojot mūsu novērojumus.
Kopumā mūsu dati apstiprina, ka augstākai GA signalizācijai ir aktīva loma šūnu dalīšanās plaknes sānu orientācijā IPR. Tie arī parāda, ka meristēmu izliekums ietekmē arī šūnu dalīšanās plaknes orientāciju IPR.
Sadalīšanas plaknes šķērsvirziena orientācija IPR augstās GA signalizācijas aktivitātes dēļ liek domāt, ka GA iepriekš organizē radiālo šūnu failu epidermā SAM ietvaros, lai noteiktu šūnu organizāciju, kas vēlāk tiks atrasta epidermas starpmezglā. Patiešām, šādi šūnu faili bieži bija redzami della globālo mutantu SAM attēlos (6.b attēls). Tādējādi, lai turpinātu izpētīt GA signalizācijas telpiskā modeļa attīstības funkciju SAM, mēs izmantojām laika intervāla attēlveidošanu, lai analizētu IPR šūnu telpisko organizāciju savvaļas tipa (Ler un Col-0), della globālajos mutantos un pCUC2::gai-1-VENUS transgēnos augos.
Mēs noskaidrojām, ka qmRGA parādīja, ka GA signalizācijas aktivitāte IPR palielinājās no P1/P2 un sasniedza maksimumu pie P4, un šis modelis laika gaitā palika nemainīgs (4.a–f att. un papildu 8.c–f, k att.). Lai analizētu šūnu telpisko organizāciju IPR ar pieaugošu GA signālu, mēs apzīmējām Ler IPR šūnas virs un uz P4 sāniem atbilstoši to attīstības liktenim, kas analizēts 34 stundas pēc pirmā novērojuma, ti, vairāk nekā divas plastida reizes, ļaujot mums sekot IPR šūnām pirmatnējās attīstības laikā no P1 / P2 līdz P4. Mēs izmantojām trīs dažādas krāsas: dzeltenu tām šūnām, kuras tika integrētas primordijā netālu no P4, zaļu tām, kuras bija IPR, un purpursarkanu tām, kuras piedalījās abos procesos (7.a–c att.). Pie t0 (0 h) P4 priekšā bija redzami 1–2 IPR šūnu slāņi (7.a att.). Kā gaidīts, kad šīs šūnas dalījās, tās galvenokārt dalījās šķērsplaknē (7.a–c att.). Līdzīgi rezultāti tika iegūti, izmantojot Col-0 SAM (fokusējoties uz P3, kura apmales krokas līdzīgi kā P4 Lerā), lai gan šajā genotipā pie ziedu robežas izveidotā kroka ātrāk paslēpa IPR šūnas (7.g–i. att.). Tādējādi IPR šūnu dalīšanas modelis iepriekš organizē šūnas radiālās rindās, tāpat kā starpmezglos. Radiālo rindu organizācija un IPR šūnu lokalizācija starp secīgiem orgāniem liecina, ka šīs šūnas ir starpmezglu priekšteči.
Šeit mēs izstrādājām ratiometrisku GA signalizācijas biosensoru qmRGA, kas ļauj kvantitatīvi kartēt GA signalizācijas aktivitāti, kas izriet no kombinētās GA un GA receptoru koncentrācijas, vienlaikus samazinot traucējumus endogēnajos signalizācijas ceļos, tādējādi nodrošinot informāciju par GA funkciju šūnu līmenī. Šim nolūkam mēs izveidojām modificētu DELLA proteīnu mRGA, kas ir zaudējis spēju saistīt DELLA mijiedarbības partnerus, bet joprojām ir jutīgs pret GA izraisītu proteolīzi. qmRGA reaģē gan uz eksogēnām, gan endogēnām izmaiņām GA līmeņos, un tā dinamiskās uztveršanas īpašības ļauj novērtēt GA signalizācijas aktivitātes spatiotemporālās izmaiņas attīstības laikā. qmRGA ir arī ļoti elastīgs rīks, jo to var pielāgot dažādiem audiem, mainot tā ekspresijai izmantoto promotoru (ja nepieciešams), un, ņemot vērā GA signalizācijas ceļa un PFYRE motīva konservēto raksturu pāri segsēkļiem, to, visticamāk, varēs pārnest uz citām sugām22. Saskaņā ar to tika pierādīts, ka līdzvērtīga mutācija rīsu SLR1 DELLA proteīnā (HYY497AAA) nomāc SLR1 augšanas nomākšanas aktivitāti, vienlaikus tikai nedaudz samazinot tā GA izraisīto degradāciju, līdzīgi kā mRGA23. Jo īpaši nesenie Arabidopsis pētījumi parādīja, ka viena aminoskābes mutācija PFYRE domēnā (S474L) mainīja RGA transkripcijas aktivitāti, neietekmējot tās spēju mijiedarboties ar transkripcijas faktoru partneriem50. Lai gan šī mutācija ir ļoti tuva 3 aminoskābju aizvietotājiem, kas atrodas mRGA, mūsu pētījumi liecina, ka šīs divas mutācijas maina atšķirīgas DELLA īpašības. Lai gan lielākā daļa transkripcijas faktoru partneru saistās ar DELLA26,51 LHR1 un SAW domēniem, dažas konservētas aminoskābes PFYRE domēnā var palīdzēt stabilizēt šīs mijiedarbības.
Starpmezglu attīstība ir galvenā iezīme augu arhitektūrā un ražas uzlabošanā. qmRGA atklāja augstāku GA signalizācijas aktivitāti IPR starpmezglu priekšteču šūnās. Apvienojot kvantitatīvo attēlveidošanu un ģenētiku, mēs parādījām, ka GA signalizācijas modeļi pārklāj apļveida / šķērsvirziena šūnu dalīšanās plaknes SAM epidermā, veidojot šūnu dalīšanās organizāciju, kas nepieciešama starpmezglu attīstībai. Izstrādes laikā ir identificēti vairāki šūnu dalīšanās plaknes orientācijas regulatori52,53. Mūsu darbs sniedz skaidru piemēru tam, kā GA signalizācijas darbība regulē šo šūnu parametru. DELLA var mijiedarboties ar pirmslocīšanas proteīnu kompleksiem41, tāpēc GA signalizācija var regulēt šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, tieši ietekmējot garozas mikrotubulu orientāciju 40, 41, 54, 55. Mēs negaidīti parādījām, ka SAM augstākas GA signalizācijas aktivitātes korelācija nebija šūnu pagarināšanās vai dalīšanās, bet tikai augšanas anizotropija, kas atbilst tiešai GA ietekmei uz šūnu dalīšanās virzienu IPR. Tomēr mēs nevaram izslēgt, ka šī ietekme varētu būt arī netieša, piemēram, ar GA izraisītu šūnu sienas mīkstināšanu56. Izmaiņas šūnu sienas īpašībās izraisa mehānisku spriegumu 57, 58, kas var ietekmēt arī šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, ietekmējot kortikālo mikrotubulu orientāciju 39, 46, 59. GA izraisītā mehāniskā sprieguma un tiešās mikrotubulu orientācijas regulēšanas ar GA kombinētā ietekme var būt saistīta ar specifiska šūnu dalīšanās orientācijas modeļa radīšanu IPR, lai definētu starpmezglus, un ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai pārbaudītu šo ideju. Līdzīgi iepriekšējie pētījumi ir uzsvēruši ar DELLA mijiedarbojošo proteīnu TCP14 un 15 nozīmi starpmezglu veidošanās kontrolē60, 61, un šie faktori var būt starpnieks GA darbībā kopā ar BREVIPEDICELLUS (BP) un PENNYWISE (PNY), kas regulē starpmezglu attīstību un ir pierādīts, ka tie ietekmē GA signalizāciju2, 62. Ņemot vērā, ka DELLA mijiedarbojas ar brassinosteroīdu, etilēna, jasmonskābes un abscisīnskābes (ABA) signalizācijas ceļiem63, 64 un ka šie hormoni var ietekmēt mikrotubulu orientāciju65, GA ietekmi uz šūnu dalīšanās orientāciju var izraisīt arī citi hormoni.
Agrīnie citoloģiskie pētījumi parādīja, ka starpmezglu attīstībai ir nepieciešami gan Arabidopsis SAM iekšējie, gan ārējie reģioni 2, 42. Fakts, ka GA aktīvi regulē šūnu dalīšanos iekšējos audos12, atbalsta divkāršo GA funkciju, regulējot meristēmu un starpmezglu izmēru SAM. Virziena šūnu dalīšanās modelis ir stingri regulēts arī iekšējos SAM audos, un šis regulējums ir būtisks cilmes augšanai52. Būs interesanti izpētīt, vai GA arī spēlē lomu šūnu dalīšanas plaknes orientēšanā iekšējā SAM organizācijā, tādējādi sinhronizējot starpmezglu specifikāciju un attīstību SAM ietvaros.
Augi tika audzēti in vitro augsnē vai 1x Murashige-Skoog (MS) barotnē (Duchefa), kas papildināta ar 1% saharozi un 1% agaru (Sigma) standarta apstākļos (16 h gaisma, 22 °C), izņemot hipokotila un sakņu augšanas eksperimentus, kuros stādi tika audzēti uz vertikālām plāksnēm pastāvīgā apgaismojumā un 22 °C temperatūrā. Nitrātu eksperimentiem augi tika audzēti uz modificētas MS barotnes (bioWORLD augu barotne), kas papildināta ar atbilstošu nitrātu (0 vai 10 mM KNO3), 0, 5 mM NH4-sukcinātu, 1% saharozi un 1% A-agaru (Sigma) ilgstošas dienas apstākļos.
GID1a cDNS, kas ievietota pDONR221, tika rekombinēta ar pDONR P4-P1R-pUBQ10 un pDONR P2R-P3-mCherry pB7m34GW, lai iegūtu pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNS, kas ievietota pDONR221, tika rekombinēta ar pB7RWG266, lai iegūtu p35S: IDD2-RFP. Lai ģenerētu pGID1b::2xmTQ2-GID1b, 3,9 kb fragments augšpus GID1b kodējošā reģiona un 4,7 kb fragments, kas satur GID1b cDNS (1,3 kb) un terminatoru (3,4 kb), vispirms tika amplificēts, izmantojot primerus 3. papildu tabulā un pēc tam PDONRcientific ievietoja p1R un Fish-P. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) un visbeidzot rekombinēts ar pDONR221 2xmTQ268 mērķa vektorā pGreen 012567, izmantojot Gateway klonēšanu. Lai ģenerētu pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotora secība (3229 bp augšpus ATG), kam sekoja lielā Stoksa nobīdītā mOrange (LSSmOrange)69 kodēšanas secība ar N7 kodola lokalizācijas signālu un NOS transkripcijas terminatoru, tika samontēta pGreen kanamicīna mērķēšanas sistēmas recom-ragmentway vektorā3. (Invitrogen). Augu binārais vektors tika ievadīts Agrobacterium tumefaciens celmā GV3101 un ievadīts Nicotiana benthamiana lapās ar Agrobacterium infiltrācijas metodi un Arabidopsis thaliana Col-0 attiecīgi ar ziedu iegremdēšanas metodi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry un pCLV3::mCherry-NLS qmRGA tika izolēti attiecīgi no attiecīgo krustojumu F3 un F1 pēcnācējiem.
RNS in situ hibridizācija tika veikta uz aptuveni 1 cm gariem dzinumu galiem72, kas tika savākti un nekavējoties fiksēti FAA šķīdumā (3, 7% formaldehīds, 5% etiķskābe, 50% etanols), kas iepriekš atdzesēts līdz 4 ° C. Pēc 2 × 15 minūšu vakuuma apstrādes fiksators tika nomainīts un paraugus inkubēja nakti. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 un RGL3 cDNS un to 3'-UTR antisense zondes tika sintezētas, izmantojot praimerus, kas parādīti 3. papildu tabulā, kā aprakstījuši Rosier et al.73. Ar digoksigenīnu iezīmētās zondes tika imūndetektētas, izmantojot digoksigenīna antivielas (3000 reižu atšķaidījums; Roche, kataloga numurs: 11 093 274 910), un sekcijas tika iekrāsotas ar 5-brom-4-hlor-3-indolilfosfātu (BCIP0/-tetranijs, dillub55) (NBT, 200-kārtīgs atšķaidījums) šķīdums.
Izlikšanas laiks: 10. februāris 2025