Dzinuma apikālā meristema (SAM) augšana ir kritiski svarīga stumbra arhitektūrai. Augu hormonigiberelīni(GA) spēlē galveno lomu augu augšanas koordinēšanā, taču to loma SAM joprojām ir vāji izpētīta. Šeit mēs izstrādājām ratiometrisku GA signālu biosensoru, inženierējot DELLA proteīnu, lai nomāktu tā būtisko regulējošo funkciju GA transkripcijas atbildē, vienlaikus saglabājot tā degradāciju pēc GA atpazīšanas. Mēs parādām, ka šis uz degradāciju balstītais biosensors precīzi reģistrē GA līmeņu izmaiņas un šūnu uztveri attīstības laikā. Mēs izmantojām šo biosensoru, lai kartētu GA signālu aktivitāti SAM. Mēs parādām, ka augsti GA signāli galvenokārt ir šūnās, kas atrodas starp orgānu aizmetņiem, kas ir internoda šūnu priekšteči. Izmantojot funkcijas iegūšanas un zaudēšanas pieejas, mēs tālāk parādām, ka GA regulē šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, izveidojot internoda kanonisko šūnu organizāciju, tādējādi veicinot internoda specifikāciju SAM.
Dzinuma apikālais meristēms (SAM), kas atrodas dzinuma virsotnē, satur cilmes šūnu nišu, kuru aktivitāte modulārā un iteratīvā veidā ģenerē sānu orgānus un stumbra mezglus visa auga dzīves laikā. Katra no šīm atkārtotajām vienībām jeb auga mezgliem ietver internodus un sānu orgānus mezglos, kā arī padušu meristemas lapu padusēs1. Augu mezglu augšana un organizācija attīstības laikā mainās. Arabidopsis gadījumā internodu augšana veģetatīvās stadijas laikā tiek nomākta, un padušu meristemas paliek snaudošas rozetes lapu padusēs. Pārejot uz ziedēšanas fāzi, SAM kļūst par ziedkopas meristemu, ģenerējot iegarenus internodus un padušu pumpurus, zariņus kātu lapu padusēs un vēlāk bezlapu ziedus2. Lai gan esam panākuši ievērojamu progresu lapu, ziedu un zaru veidošanās iniciācijas kontrolējošo mehānismu izpratnē, salīdzinoši maz ir zināms par to, kā rodas internodi.
Izpratne par GA telpiski emporālo sadalījumu palīdzēs labāk izprast šo hormonu funkcijas dažādos audos un dažādās attīstības stadijās. RGA-GFP saplūšanas degradācijas vizualizācija, kas ekspresēta sava promotera darbības rezultātā, sniedz svarīgu informāciju par kopējā GA līmeņa regulēšanu saknēs15,16. Tomēr RGA ekspresija dažādos audos atšķiras17 un to regulē GA18. Tādējādi RGA promotera atšķirīgā ekspresija var izraisīt fluorescences modeli, kas novērots ar RGA-GFP, un tāpēc šī metode nav kvantitatīva. Pavisam nesen bioaktīvais fluoresceīna (Fl) iezīmētais GA19,20 atklāja GA uzkrāšanos sakņu endokorteksā un tā šūnu līmeņa regulēšanu ar GA transportu. Nesen GA FRET sensors nlsGPS1 parādīja, ka GA līmenis korelē ar šūnu pagarināšanos saknēs, pavedienos un tumši audzētos hipokotilos21. Tomēr, kā redzējām, GA koncentrācija nav vienīgais parametrs, kas kontrolē GA signalizācijas aktivitāti, jo tā ir atkarīga no sarežģītiem sensoru procesiem. Šeit, balstoties uz mūsu izpratni par DELLA un GA signālceļiem, mēs ziņojam par degradācijas balstīta ratiometriska biosensora izstrādi un raksturojumu GA signālceļiem. Lai izstrādātu šo kvantitatīvo biosensoru, mēs izmantojām mutantu GA jutīgu RGA, kas tika sapludināts ar fluorescējošu proteīnu un visuresoši ekspresēts audos, kā arī GA nejutīgu fluorescējošu proteīnu. Mēs parādām, ka mutantu RGA proteīnu sapludinājumi netraucē endogēno GA signālceļus, kad tie tiek visuresoši ekspresēti, un ka šis biosensors var kvantitatīvi noteikt signālceļu aktivitāti, kas rodas gan no GA ievades, gan no GA signāla apstrādes ar sensoru aparātu ar augstu telplaika izšķirtspēju. Mēs izmantojām šo biosensoru, lai kartētu GA signālceļu aktivitātes telplaika sadalījumu un kvantitatīvi noteiktu, kā GA regulē šūnu uzvedību SAM epidermā. Mēs parādām, ka GA regulē SAM šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, kas atrodas starp orgānu aizmetņiem, tādējādi definējot internoda kanonisko šūnu organizāciju.
Visbeidzot, mēs jautājām, vai qmRGA varētu ziņot par endogēnā GA līmeņa izmaiņām, izmantojot augošus hipokotilas. Iepriekš mēs parādījām, ka nitrāts stimulē augšanu, palielinot GA sintēzi un līdz ar to DELLA34 degradāciju. Attiecīgi mēs novērojām, ka hipokotila garums pUBQ10::qmRGA stādos, kas audzēti bagātīgā nitrātu piegādē (10 mM NO3−), bija ievērojami lielāks nekā stādos, kas audzēti nitrātu deficīta apstākļos (6.a papildattēls). Atbilstoši augšanas reakcijai, GA signāli bija augstāki stādu hipokotila augos, kas audzēti 10 mM NO3− apstākļos, nekā stādos, kas audzēti bez nitrāta (6.b, c papildattēls). Tādējādi qmRGA ļauj arī uzraudzīt GA signālu izmaiņas, ko izraisa endogēnas GA koncentrācijas izmaiņas.
Lai saprastu, vai qmRGA noteiktā GA signāltransdukcijas aktivitāte ir atkarīga no GA koncentrācijas un GA uztveres, kā paredzēts, pamatojoties uz sensora dizainu, mēs analizējām trīs GID1 receptoru ekspresiju veģetatīvajos un reproduktīvajos audos. Stādos GID1-GUS reportiera līnija parādīja, ka GID1a un c bija izteikti ekspresēti dīgļlapās (3.a–c. att.). Turklāt visi trīs receptori tika ekspresēti lapās, sānu sakņu aizsegos, sakņu galos (izņemot GID1b saknes cepurīti) un asinsvadu sistēmā (3.a–c. att.). Ziedkopas SAM mēs konstatējām GUS signālus tikai GID1b un 1c (7.a–c. papildattēls). In situ hibridizācija apstiprināja šos ekspresijas modeļus un tālāk parādīja, ka GID1c bija vienmērīgi ekspresēts zemā līmenī SAM, savukārt GID1b uzrādīja augstāku ekspresiju SAM perifērijā (7.d–l. papildattēls). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translācijas saplūšana atklāja arī pakāpenisku GID1b ekspresijas diapazonu, sākot no zemas vai nekādas ekspresijas SAM centrā līdz augstai ekspresijai orgānu robežās (7.m papildattēls). Tādējādi GID1 receptori nav vienmērīgi sadalīti audos un to iekšienē. Turpmākajos eksperimentos mēs arī novērojām, ka GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) pārekspresija palielināja qmRGA jutību hipokotilos pret ārēju GA pielietojumu (3.d, e att.). Turpretī fluorescence, kas izmērīta ar qd17mRGA hipokotilā, nebija jutīga pret GA3 apstrādi (3.f, g att.). Abos testos stādus apstrādāja ar augstu GA koncentrāciju (100 μM GA3), lai novērtētu sensora ātro uzvedību, kur spēja saistīties ar GID1 receptoru bija uzlabota vai zaudēta. Kopā šie rezultāti apstiprina, ka qmRGA biosensors kalpo kā kombinēta GA un GA sensora funkcija, un liecina, ka GID1 receptora atšķirīgā ekspresija var būtiski modulēt sensora emisiju.
Līdz šim GA signālu sadalījums SAM joprojām nav skaidrs. Tāpēc mēs izmantojām qmRGA ekspresējošus augus un pCLV3::mCherry-NLS cilmes šūnu reportieri35, lai aprēķinātu augstas izšķirtspējas kvantitatīvas GA signālceļu aktivitātes kartes, koncentrējoties uz L1 slāni (epidermu; 4.a, b att., skatīt Metodes un Papildu metodes), jo L1 ir galvenā loma SAM augšanas kontrolē36. Šeit pCLV3::mCherry-NLS ekspresija nodrošināja fiksētu ģeometrisku atskaites punktu GA signālceļu aktivitātes telpiski-laicīgā sadalījuma analīzei37. Lai gan GA tiek uzskatīts par būtisku sānu orgānu attīstībai4, mēs novērojām, ka GA signāli ziedu sākumposmā (P) bija zemi, sākot no P3 stadijas (4.a, b att.), savukārt jauniem P1 un P2 sākumposmiem bija mērena aktivitāte, līdzīga tai centrālajā reģionā (4.a, b att.). Augstāka GA signāltransdukciju aktivitāte tika konstatēta orgānu aizmetņu robežās, sākot no P1/P2 (robežas sānos) un sasniedzot maksimumu pie P4, kā arī visās perifērā reģiona šūnās, kas atrodas starp aizmetņiem (4.a, b attēls un 8.a, b papildattēls). Šī augstākā GA signāltransdukciju aktivitāte tika novērota ne tikai epidermā, bet arī L2 un augšējā L3 slānī (8.b papildattēls). Arī qmRGA izmantotajā SAM noteiktais GA signālu modelis laika gaitā nemainījās (8.c–f, k papildattēls). Lai gan qd17mRGA konstrukcija tika sistemātiski samazināta T3 augu SAM no piecām neatkarīgām līnijām, kuras mēs detalizēti raksturojām, mēs varējām analizēt fluorescences modeļus, kas iegūti ar pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstrukciju (8.g–j, l papildattēls). Šajā kontroles līnijā SAM tika konstatētas tikai nelielas fluorescences attiecības izmaiņas, bet SAM centrā mēs novērojām skaidru un negaidītu ar TagBFP saistītā VENUS samazināšanos. Tas apstiprina, ka qmRGA novērotais signālceļu modelis atspoguļo no GA atkarīgu mRGA-VENUS degradāciju, bet arī parāda, ka qmRGA var pārvērtēt GA signālceļu aktivitāti meristēmas centrā. Rezumējot, mūsu rezultāti atklāj GA signālceļu modeli, kas galvenokārt atspoguļo primordiju sadalījumu. Šis starpprimordālā reģiona (IPR) sadalījums ir saistīts ar pakāpenisku augstas GA signālceļu aktivitātes izveidošanos starp attīstošos primordiju un centrālo reģionu, vienlaikus samazinoties GA signālceļu aktivitātei primordijā (4.c, d att.).
GID1b un GID1c receptoru sadalījums (skatīt iepriekš) liecina, ka GA receptoru diferenciālā ekspresija palīdz veidot GA signāltransdukcijas aktivitātes modeli SAM. Mēs domājām, vai varētu būt iesaistīta GA diferenciālā uzkrāšanās. Lai izpētītu šo iespēju, mēs izmantojām nlsGPS1 GA FRET sensoru21. NlsGPS1 SAM, kas apstrādāts ar 10 μM GA4+7 100 minūtes, tika konstatēta paaugstināta aktivācijas frekvence (9.a–e papildattēls), kas norāda, ka nlsGPS1 reaģē uz GA koncentrācijas izmaiņām SAM, tāpat kā saknēs21. NlsGPS1 aktivācijas frekvences telpiskais sadalījums atklāja relatīvi zemu GA līmeni SAM ārējos slāņos, bet parādīja, ka tie bija paaugstināti SAM centrā un malās (4.e att. un 9.a,c papildattēls). Tas liecina, ka GA ir izplatīts arī SAM ar telpisko modeli, kas ir salīdzināms ar qmRGA atklāto. Kā papildinošu pieeju mēs apstrādājām SAM arī ar fluorescējošu GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) vai tikai Fl kā negatīvu kontroli. Fl signāls tika izplatīts visā SAM, ieskaitot centrālo reģionu un sākumpunktu, lai gan ar zemāku intensitāti (4.j attēls un 10.d papildattēls). Turpretī visi trīs GA-Fl uzkrājās specifiski sākumpunkta robežās un dažādā mērā pārējā IP R daļā, GA7-Fl uzkrājoties lielākajā domēnā IP R (4.k attēls un 10.a,b papildattēls). Fluorescences intensitātes kvantitatīva noteikšana atklāja, ka IP R un ne-IP R intensitātes attiecība bija augstāka ar GA-Fl apstrādātajā SAM salīdzinājumā ar Fl apstrādāto SAM (4.l attēls un 10.c papildattēls). Kopā šie rezultāti liecina, ka GA ir lielākās koncentrācijās IP R šūnās, kas atrodas vistuvāk orgānu robežām. Tas liecina, ka SAM GA signalizācijas aktivitātes modelis izriet gan no GA receptoru diferenciālās ekspresijas, gan no GA diferenciālās uzkrāšanās IP R šūnās orgānu robežu tuvumā. Tādējādi mūsu analīze atklāja negaidītu GA signalizācijas telpiski laika modeli ar zemāku aktivitāti SAM centrā un sākumpunktā un augstāku aktivitāti IPR perifērajā reģionā.
Lai izprastu diferenciālās GA signāltransdukcijas aktivitātes lomu SAM, mēs analizējām korelāciju starp GA signāltransdukciju, šūnu paplašināšanos un šūnu dalīšanos, izmantojot SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS reāllaika laika intervāla attēlveidošanu. Ņemot vērā GA lomu augšanas regulēšanā, bija sagaidāma pozitīva korelācija ar šūnu paplašināšanās parametriem. Tāpēc vispirms salīdzinājām GA signāltransdukcijas aktivitātes kartes ar šūnu virsmas augšanas ātruma kartēm (kā šūnu paplašināšanās stipruma aizstājēju dotajai šūnai un meitas šūnām dalīšanās laikā) un ar augšanas anizotropijas kartēm, kas mēra šūnu paplašināšanās virzienu (arī šeit izmantota dotajai šūnai un meitas šūnām dalīšanās laikā; 5.a,b att., sk. Metodes un papildmetodes). Mūsu SAM šūnu virsmas augšanas ātruma kartes atbilst iepriekšējiem novērojumiem38,39, ar minimālu augšanas ātrumu pie robežas un maksimālu augšanas ātrumu attīstošos ziedos (5.a att.). Galveno komponentu analīze (PCA) parādīja, ka GA signāltransdukcija bija negatīvi korelēta ar šūnu virsmas augšanas intensitāti (5.c attēls). Mēs arī parādījām, ka galvenās variācijas asis, tostarp GA signālvadības ieeja un augšanas intensitāte, bija ortogonālas virzienam, ko noteica augsta CLV3 ekspresija, apstiprinot šūnu izslēgšanu no SAM centra atlikušajās analīzēs. Spīrmena korelācijas analīze apstiprināja PCA rezultātus (5.d attēls), norādot, ka augstāki GA signāli IPR neizraisīja lielāku šūnu ekspansiju. Tomēr korelācijas analīze atklāja nelielu pozitīvu korelāciju starp GA signālvadības aktivitāti un augšanas anizotropiju (5.c, d attēls), kas liecina, ka augstāks GA signālvadījums IPR ietekmē šūnu augšanas virzienu un, iespējams, šūnu dalīšanās plaknes pozīciju.
a, b SAM vidējās virsmas augšanas (a) un augšanas anizotropijas (b) siltuma kartes, kas aprēķinātas septiņiem neatkarīgiem augiem (attiecīgi izmantoti kā šūnu paplašināšanās stipruma un virziena aizstājēji). c PCA analīze ietvēra šādus mainīgos: GA signālu, virsmas augšanas intensitāti, virsmas augšanas anizotropiju un CLV3 ekspresiju. PCA 1. komponents galvenokārt negatīvi korelēja ar virsmas augšanas intensitāti un pozitīvi korelēja ar GA signālu. PCA 2. komponents galvenokārt pozitīvi korelēja ar virsmas augšanas anizotropiju un negatīvi korelēja ar CLV3 ekspresiju. Procenti atspoguļo katra komponenta izskaidroto variāciju. d Spīrmena korelācijas analīze starp GA signālu, virsmas augšanas intensitāti un virsmas augšanas anizotropiju audu mērogā, izņemot CZ. Skaitlis labajā pusē ir Spīrmena rho vērtība starp diviem mainīgajiem. Zvaigznītes norāda gadījumus, kad korelācija/negatīvā korelācija ir ļoti nozīmīga. e Col-0 SAM L1 šūnu 3D vizualizācija, izmantojot konfokālo mikroskopiju. Jaunās šūnu sieniņas, kas izveidojušās SAM (bet ne aizmetnī) 10 stundu laikā, ir iekrāsotas atbilstoši to leņķa vērtībām. Krāsu josla ir parādīta apakšējā labajā stūrī. Ieliktnī redzams atbilstošais 3D attēls 0 h brīdī. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. f Kārbu diagrammas parāda šūnu dalīšanās ātrumu IPR un ne-IPR Col-0 SAM (n = 10 neatkarīgi augi). Centrālā līnija parāda mediānu, un kārbu robežas norāda 25. un 75. procentīles. Ūsas norāda minimālās un maksimālās vērtības, kas noteiktas ar R programmatūru. P vērtības tika iegūtas, izmantojot Velča divpusējo t-testu. g, h Shematiska diagramma, kurā parādīts (g) kā izmērīt jaunās šūnas sieniņas (fuksīna) leņķi attiecībā pret radiālo virzienu no SAM centra (balta punktēta līnija) (tiek ņemtas vērā tikai šaurā leņķa vērtības, t.i., 0–90°), un (h) apkārtmēra/sānu un radiālo virzienu meristēmā. i Šūnu dalīšanās plaknes orientācijas frekvences histogrammas attiecīgi pāri SAM (tumši zila), IPR (vidēji zila) un ne-IPR (gaiši zila). P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusēju Kolmogorova-Smirnova testu. Eksperiments tika atkārtots divas reizes, iegūstot līdzīgus rezultātus. j Šūnu dalīšanās plaknes orientācijas frekvences histogrammas IPR attiecīgi ap P3 (gaiši zaļa), P4 (vidēji zaļa) un P5 (tumši zaļa). P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusēju Kolmogorova-Smirnova testu. Eksperiments tika atkārtots divas reizes, iegūstot līdzīgus rezultātus.
Tāpēc mēs tālāk pētījām korelāciju starp GA signalizāciju un šūnu dalīšanās aktivitāti, identificējot jaunizveidotās šūnu sieniņas testa laikā (5.e att.). Šī pieeja ļāva mums izmērīt šūnu dalīšanās biežumu un virzienu. Pārsteidzoši, mēs atklājām, ka šūnu dalīšanās biežums IPR un pārējā SAM (bez IPR, 5.f att.) bija līdzīgs, kas norāda, ka GA signalizācijas atšķirības starp IPR un ne-IPR šūnām būtiski neietekmē šūnu dalīšanos. Tas un pozitīvā korelācija starp GA signalizāciju un augšanas anizotropiju pamudināja mūs apsvērt, vai GA signalizācijas aktivitāte varētu ietekmēt šūnu dalīšanās plaknes orientāciju. Mēs izmērījām jaunās šūnas sienas orientāciju kā šauru leņķi attiecībā pret radiālo asi, kas savieno meristema centru un jaunās šūnas sienas centru (5.e-i att.), un novērojām skaidru tendenci šūnām dalīties leņķos, kas ir tuvu 90° attiecībā pret radiālo asi, ar visaugstākajām frekvencēm, kas novērotas 70–80° (23,28%) un 80–90° (22,62%) (5.e,i att.), kas atbilst šūnu dalīšanai apkārtmēra/šķērsvirzienā (5.h att.). Lai pārbaudītu GA signālu ietekmi uz šo šūnu dalīšanās uzvedību, mēs analizējām šūnu dalīšanās parametrus IPR un ne-IPR atsevišķi (5.i att.). Mēs novērojām, ka dalīšanās leņķa sadalījums IP R šūnās atšķīrās no sadalījuma šūnās bez IP R vai šūnās visā SAM, IP R šūnām uzrādot lielāku laterālo/apļveida šūnu dalījumu īpatsvaru, t.i., 70–80° un 80–90° (attiecīgi 33,86% un 30,71%, atbilstošās proporcijas) (5.i att.). Tādējādi mūsu novērojumi atklāja saistību starp augstu GA signalizāciju un šūnu dalīšanās plaknes orientāciju tuvu apkārtmēra virzienam, līdzīgi kā korelācija starp GA signalizācijas aktivitāti un augšanas anizotropiju (5.c, d att.). Lai vēl vairāk noteiktu šīs saistības telpisko saglabāšanu, mēs izmērījām dalīšanās plaknes orientāciju IP R šūnās ap sākumpunktu, sākot no P3, jo visaugstākā GA signalizācijas aktivitāte tika konstatēta šajā reģionā, sākot no P4 (4. att.). IPR dalīšanās leņķi ap P3 un P4 neuzrādīja statistiski nozīmīgas atšķirības, lai gan IPR ap P4 tika novērota palielināta laterālo šūnu dalīšanās biežums (5.j att.). Tomēr IP R šūnās ap P5 šūnu dalīšanās plaknes orientācijas atšķirība kļuva statistiski nozīmīga, strauji palielinoties šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežumam (5.j att.). Kopā šie rezultāti liecina, ka GA signalizācija var kontrolēt šūnu dalīšanās orientāciju SAM, kas atbilst iepriekšējiem ziņojumiem40,41, ka augsta GA signalizācija var izraisīt šūnu dalīšanās laterālo orientāciju IP R.
Tiek prognozēts, ka IPR šūnas netiks iekļautas aizmetņos, bet gan internodos2,42,43. Šūnu dalīšanās šķērsvirziena orientācija IPR var izraisīt epidermas šūnu paralēlu garenisku rindu tipisku organizāciju internodos. Mūsu iepriekš aprakstītie novērojumi liecina, ka GA signalizācijai, iespējams, ir nozīme šajā procesā, regulējot šūnu dalīšanās virzienu.
Vairāku DELLA gēnu funkcijas zudums izraisa konstitutīvu GA atbildi, un della mutantus var izmantot, lai pārbaudītu šo hipotēzi44. Vispirms mēs analizējām piecu DELLA gēnu ekspresijas modeļus SAM. GUS līnijas45 transkripcijas saplūšana atklāja, ka GAI, RGA, RGL1 un RGL2 (daudz mazākā mērā) tika ekspresēti SAM (11.a–d papildattēls). In situ hibridizācija arī parādīja, ka GAI mRNS uzkrājas specifiski sākumposmā un attīstošos ziedos (11.e papildattēls). RGL1 un RGL3 mRNS tika konstatēta visā SAM vainagā un vecākos ziedos, savukārt RGL2 mRNS bija vairāk sastopama pierobežas reģionā (11.f–h papildattēls). pRGL3::RGL3-GFP SAM konfokālā attēlveidošana apstiprināja in situ hibridizācijas laikā novēroto ekspresiju un parādīja, ka RGL3 proteīns uzkrājas SAM centrālajā daļā (11.i papildattēls). Izmantojot pRGA::GFP-RGA līniju, mēs arī atklājām, ka RGA proteīns uzkrājas SAM, bet tā daudzums samazinās uz robežas, sākot no P4 (11.j papildinājums). Jāatzīmē, ka RGL3 un RGA ekspresijas modeļi atbilst augstākai GA signalizācijas aktivitātei IPR, ko noteica qmRGA (4. att.). Turklāt šie dati liecina, ka visas DELLA tiek ekspresētas SAM un ka to ekspresija kopumā aptver visu SAM.
Pēc tam mēs analizējām šūnu dalīšanās parametrus savvaļas tipa SAM (Ler, kontrole) un gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della kvintuple (globālie) mutanti (6.a, b att.). Interesanti, ka mēs novērojām statistiski nozīmīgu šūnu dalīšanās leņķu biežuma sadalījuma nobīdi della globālajā mutantā SAM, salīdzinot ar savvaļas tipu (6.c att.). Šīs izmaiņas della globālajā mutantā bija saistītas ar 80–90° leņķu biežuma palielināšanos (34,71% pret 24,55%) un mazākā mērā ar 70–80° leņķu biežuma palielināšanos (23,78% pret 20,18%), t.i., kas atbilst šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežumam (6.c att.). Arī nešķērsvirziena dalīšanās biežums (0–60°) della globālajā mutantā bija zemāks (6.c att.). Šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežums della globālā mutanta SAM bija ievērojami palielināts (6.b att.). Arī šķērsvirziena šūnu dalīšanās biežums IPR bija augstāks della globālajā mutantā, salīdzinot ar savvaļas tipu (6.d att.). Ārpus IPR reģiona savvaļas tipam bija vienmērīgāks šūnu dalīšanās leņķu sadalījums, savukārt della globālais mutants deva priekšroku tangenciālai dalīšanai, tāpat kā IPR (6.e att.). Mēs arī kvantitatīvi noteicām šūnu dalīšanās orientāciju ga2 oksidāzes (ga2ox) kvintuples mutantu (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 un ga2ox6-2) SAM, kas ir GA-neaktīvs mutantu fons, kurā uzkrājas GA. Atbilstoši GA līmeņa pieaugumam, pieckāršās ga2ox mutanta ziedkopas SAM bija lielāks nekā Col-0 (12.a, b papildattēls), un, salīdzinot ar Col-0, pieckāršajai ga2ox SAM bija izteikti atšķirīgs šūnu dalīšanās leņķu sadalījums, leņķa frekvencei palielinoties no 50° līdz 90°, t.i., atkal dodot priekšroku tangenciālai dalīšanai (12.a–c papildattēls). Tādējādi mēs parādām, ka GA signālu konstitutīvā aktivācija un GA uzkrāšanās izraisa laterālu šūnu dalīšanos IPR un pārējā SAM daļā.
a, b PI iekrāsotā Ler (a) un globālā della mutanta (b) SAM L1 slāņa 3D vizualizācija, izmantojot konfokālo mikroskopiju. Attēlā redzamas jaunās šūnu sieniņas, kas izveidojušās SAM (bet ne sākumposmā) 10 stundu laikā, un tās ir iekrāsotas atbilstoši to leņķu vērtībām. Ieliktnī redzams SAM 0 h brīdī. Krāsu josla ir parādīta apakšējā labajā stūrī. Bultiņa (b) norāda uz izlīdzinātu šūnu failu piemēru globālajā della mutantā. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. ce šūnu dalīšanās plaknes orientāciju biežuma sadalījuma salīdzinājums visā SAM (d), IPR (e) un ne-IPR (f) starp Ler un globālo della. P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusēju Kolmogorova-Smirnova testu. f, g PI iekrāsoto Col-0 (i) un pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgēno augu SAM konfokālo attēlu 3D vizualizācija. Paneļos (a, b) redzamas jaunas šūnu sieniņas (bet ne aizmetņi), kas izveidojušās SAM 10 stundu laikā. Eksperiments tika atkārtots divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem. h–j Šūnu dalīšanās plaknes orientāciju biežuma sadalījuma salīdzinājums visā SAM (h), IPR (i) un ne-IPR (j) starp Col-0 un pCUC2::gai-1-VENUS augiem. P vērtības tika iegūtas, izmantojot divpusēju Kolmogorova-Smirnova testu.
Pēc tam mēs pārbaudījām GA signalizācijas inhibīcijas ietekmi tieši IP R. Šim nolūkam mēs izmantojām dīgļlapu kausa 2 (CUC2) promotoru, lai virzītu dominējošā negatīvā gai-1 proteīna, kas sapludināts ar VENUS, ekspresiju (pCUC2::gai-1-VENUS līnijā). Savvaļas tipa SAM CUC2 promotors virza vairuma IP R ekspresiju SAM, tostarp robežšūnās, sākot no P4, un līdzīga specifiska ekspresija tika novērota pCUC2::gai-1-VENUS augos (skatīt zemāk). Šūnu dalīšanās leņķu sadalījums pCUC2::gai-1-VENUS augu SAM vai IP R būtiski neatšķīrās no savvaļas tipa, lai gan negaidīti mēs atklājām, ka šūnas bez IP R šajos augos dalījās ar augstāku frekvenci - 80–90° (6.f–j att.).
Ir izteikts pieņēmums, ka šūnu dalīšanās virziens ir atkarīgs no SAM ģeometrijas, jo īpaši no audu izliekuma radītā stiepes sprieguma46. Tāpēc mēs jautājām, vai SAM forma ir mainījusies della globālajā mutantā un pCUC2::gai-1-VENUS augos. Kā ziņots iepriekš12, della globālā mutanta SAM izmērs bija lielāks nekā savvaļas tipam (13.a, b, d papildattēls). CLV3 un STM RNS in situ hibridizācija apstiprināja meristēmas paplašināšanos della mutantos un tālāk parādīja cilmes šūnu nišas laterālo paplašināšanos (13.e, f, h, i papildattēls). Tomēr SAM izliekums abos genotipos bija līdzīgs (13.k, m, n, p papildattēls). Mēs novērojām līdzīgu izmēra palielināšanos gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della četrkāršajā mutantā bez izliekuma izmaiņām salīdzinājumā ar savvaļas tipu (13.c, d, g, j, l, o, p papildattēls). Šūnu dalīšanās orientācijas biežums tika ietekmēts arī della četrkāršajā mutantā, bet mazākā mērā nekā della monolītajā mutantā (12.d–f. papildattēls). Šis devas efekts kopā ar ietekmes trūkumu uz izliekumu liecina, ka atlikušā RGL3 aktivitāte Della četrkāršajā mutantā ierobežo šūnu dalīšanās orientācijas izmaiņas, ko izraisa DELLA aktivitātes zudums, un ka izmaiņas sānu šūnu dalīšanās notiek, reaģējot uz GA signalizācijas aktivitātes izmaiņām, nevis uz SAM ģeometrijas izmaiņām. Kā aprakstīts iepriekš, CUC2 promoters virza IPR ekspresiju SAM, sākot no P4 (14.a, b. papildattēls), un turpretī pCUC2::gai-1-VENUS SAM bija samazināts izmērs, bet lielāks izliekums (14.c–h. papildattēls). Šīs pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfoloģijas izmaiņas var izraisīt atšķirīgu mehānisko spriegumu sadalījumu salīdzinājumā ar savvaļas tipu, kurā lieli apkārtmēra spriegumi sākas īsākā attālumā no SAM centra47. Alternatīvi, izmaiņas pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfoloģijā var rasties transgēnu ekspresijas izraisītu reģionālo mehānisko īpašību izmaiņu rezultātā48. Abos gadījumos tas varētu daļēji kompensēt GA signalizācijas izmaiņu ietekmi, palielinot varbūtību, ka šūnas dalīsies apkārtmēra/šķērsvirziena orientācijā, kas izskaidro mūsu novērojumus.
Kopumā mūsu dati apstiprina, ka augstāka GA signalizācija spēlē aktīvu lomu šūnu dalīšanās plaknes laterālajā orientācijā IPR. Tie arī parāda, ka meristēmas izliekums ietekmē arī šūnu dalīšanās plaknes orientāciju IPR.
Šķērsvirziena dalīšanās plaknes orientācija IPR, ko izraisa augsta GA signāltranslācijas aktivitāte, liecina, ka GA iepriekš organizē radiālu šūnu failu epidermā SAM ietvaros, lai definētu šūnu organizāciju, kas vēlāk tiks atrasta epidermas internodā. Šādi šūnu faili patiešām bija bieži redzami della globālo mutantu SAM attēlos (6.b att.). Tādējādi, lai sīkāk izpētītu GA signāltranslācijas telpiskā modeļa attīstības funkciju SAM, mēs izmantojām laika intervāla attēlveidošanu, lai analizētu šūnu telpisko organizāciju IPR savvaļas tipa (Ler un Col-0), della globālo mutantu un pCUC2::gai-1-VENUS transgēno augu gadījumā.
Mēs atklājām, ka qmRGA parādīja, ka GA signalizācijas aktivitāte IPR palielinājās no P1/P2 un sasniedza maksimumu pie P4, un šis modelis laika gaitā saglabājās nemainīgs (4.a–f. att. un 8.c–f., k. papildatt.). Lai analizētu šūnu telpisko organizāciju IPR, palielinoties GA signālam, mēs iezīmējām Ler IPR šūnas virs un sānos no P4 atbilstoši to attīstības liktenim, kas tika analizēts 34 stundas pēc pirmā novērojuma, t.i., vairāk nekā divas plastidas reizes, ļaujot mums sekot IPR šūnām primordija attīstības laikā no P1/P2 līdz P4. Mēs izmantojām trīs dažādas krāsas: dzeltenu tām šūnām, kas bija integrētas primordijā pie P4, zaļu tām, kas atradās IPR, un violetu tām, kas piedalījās abos procesos (7.a–c. att.). Pie t0 (0 h) P4 priekšā bija redzami 1–2 IPR šūnu slāņi (7.a att.). Kā paredzēts, kad šīs šūnas dalījās, tās to darīja galvenokārt caur šķērsvirziena dalīšanās plakni (7.a–c. att.). Līdzīgi rezultāti tika iegūti, izmantojot Col-0 SAM (koncentrējoties uz P3, kura robeža krokojas līdzīgi kā P4 Ler), lai gan šajā genotipā ziedu robežā izveidotā kroka ātrāk paslēpa IPR šūnas (7.g–i att.). Tādējādi IPR šūnu dalīšanās modelis iepriekš organizē šūnas radiālās rindās, tāpat kā internodos. Radiālo rindu organizācija un IPR šūnu lokalizācija starp secīgiem orgāniem liecina, ka šīs šūnas ir internodāli priekšteči.
Šeit mēs izstrādājām ratiometrisku GA signalizācijas biosensoru qmRGA, kas ļauj kvantitatīvi kartēt GA signalizācijas aktivitāti, kas rodas no kombinētām GA un GA receptoru koncentrācijām, vienlaikus samazinot traucējumus endogēnajos signalizācijas ceļos, tādējādi sniedzot informāciju par GA funkciju šūnu līmenī. Šajā nolūkā mēs konstruējām modificētu DELLA proteīnu mRGA, kas ir zaudējis spēju saistīties ar DELLA mijiedarbības partneriem, bet saglabā jutību pret GA izraisītu proteolīzi. qmRGA reaģē gan uz eksogēnām, gan endogēnām izmaiņām GA līmeņos, un tā dinamiskās uztveršanas īpašības ļauj novērtēt GA signalizācijas aktivitātes telpiski-laicīgas izmaiņas attīstības laikā. qmRGA ir arī ļoti elastīgs rīks, jo to var pielāgot dažādiem audiem, mainot tā ekspresijai izmantoto promotoru (ja nepieciešams), un, ņemot vērā GA signalizācijas ceļa konservatīvo raksturu un PFYRE motīvu segsēkļos, to, visticamāk, varēs pārnest uz citām sugām22. Saskaņā ar to tika pierādīts, ka līdzvērtīga mutācija rīsu SLR1 DELLA proteīnā (HYY497AAA) nomāc SLR1 augšanas represora aktivitāti, vienlaikus tikai nedaudz samazinot tā GA mediēto degradāciju, līdzīgi kā mRGA23. Jāatzīmē, ka nesen veiktie pētījumi ar Arabidopsis parādīja, ka vienas aminoskābes mutācija PFYRE domēnā (S474L) mainīja RGA transkripcijas aktivitāti, neietekmējot tā spēju mijiedarboties ar transkripcijas faktoru partneriem50. Lai gan šī mutācija ir ļoti tuva 3 aminoskābju aizvietojumiem, kas atrodas mRGA, mūsu pētījumi liecina, ka šīs divas mutācijas maina atšķirīgas DELLA īpašības. Lai gan lielākā daļa transkripcijas faktoru partneru saistās ar DELLA26,51 LHR1 un SAW domēniem, dažas konservētas aminoskābes PFYRE domēnā var palīdzēt stabilizēt šo mijiedarbību.
Starpmezglu attīstība ir galvenā iezīme augu arhitektūrā un ražas uzlabošanā. qmRGA atklāja augstāku GA signālaktivitāti IPR starpmezglu cilmes šūnās. Apvienojot kvantitatīvo attēlveidošanu un ģenētiku, mēs parādījām, ka GA signālmodeļi pārklājas ar apļveida/šķērsvirziena šūnu dalīšanās plaknēm SAM epidermā, veidojot šūnu dalīšanās organizāciju, kas nepieciešama starpmezglu attīstībai. Attīstības laikā ir identificēti vairāki šūnu dalīšanās plaknes orientācijas regulatori52,53. Mūsu darbs sniedz skaidru piemēru tam, kā GA signālmodeļu aktivitāte regulē šo šūnu parametru. DELLA var mijiedarboties ar iepriekš salocītiem olbaltumvielu kompleksiem41, tāpēc GA signālmodeļi var regulēt šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, tieši ietekmējot kortikālo mikrotubulu orientāciju40,41,54,55. Mēs negaidīti parādījām, ka SAM augstākas GA signālmodeļu aktivitātes korelāts nebija šūnu pagarināšanās vai dalīšanās, bet tikai augšanas anizotropija, kas atbilst GA tiešai ietekmei uz šūnu dalīšanās virzienu IPR. Tomēr mēs nevaram izslēgt, ka šī ietekme varētu būt arī netieša, piemēram, mediēta ar GA izraisītu šūnu sieniņu mīkstināšanu56. Šūnu sieniņu īpašību izmaiņas izraisa mehānisku spriegumu57,58, kas var ietekmēt arī šūnu dalīšanās plaknes orientāciju, ietekmējot kortikālo mikrotubulu orientāciju39,46,59. GA izraisītā mehāniskā stresa un GA tiešās mikrotubulu orientācijas regulēšanas kombinētā ietekme var būt saistīta ar specifiska šūnu dalīšanās orientācijas modeļa radīšanu IPR, lai definētu internodus, un ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai pārbaudītu šo ideju. Līdzīgi iepriekšējie pētījumi ir uzsvēruši DELLA mijiedarbojošos proteīnu TCP14 un 15 nozīmi internodu veidošanās kontrolē60,61, un šie faktori var mediēt GA darbību kopā ar BREVIPEDICELLUS (BP) un PENNYWISE (PNY), kas regulē internodu attīstību un ir pierādīts, ka tie ietekmē GA signalizāciju2,62. Ņemot vērā, ka DELLA mijiedarbojas ar brassinosteroīdu, etilēna, jasmonskābes un abscisīnskābes (ABA) signalizācijas ceļiem63,64 un ka šie hormoni var ietekmēt mikrotubulu orientāciju65, GA ietekmi uz šūnu dalīšanās orientāciju var mediēt arī citi hormoni.
Agrīnie citoloģiskie pētījumi parādīja, ka gan Arabidopsis SAM iekšējie, gan ārējie reģioni ir nepieciešami internoda attīstībai2,42. Fakts, ka GA aktīvi regulē šūnu dalīšanos iekšējos audos12, apstiprina GA divējādu funkciju, regulējot meristēmas un internoda izmēru SAM. Virziena šūnu dalīšanās modelis ir stingri regulēts arī iekšējos SAM audos, un šī regulācija ir būtiska stumbra augšanai52. Būs interesanti izpētīt, vai GA spēlē arī lomu šūnu dalīšanās plaknes orientēšanā iekšējā SAM organizācijā, tādējādi sinhronizējot internoda specifikāciju un attīstību SAM ietvaros.
Augi tika audzēti in vitro augsnē vai 1x Murashige-Skoog (MS) vidē (Duchefa), kas papildināta ar 1% saharozes un 1% agara (Sigma), standarta apstākļos (16 h gaismas, 22 °C), izņemot hipokotila un sakņu augšanas eksperimentus, kuros stādi tika audzēti uz vertikālām plāksnēm pastāvīgā apgaismojumā un 22 °C temperatūrā. Nitrātu eksperimentiem augi tika audzēti modificētā MS vidē (bioWORLD augu barotne), kas papildināta ar atbilstošu nitrātu daudzumu (0 vai 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-sukcinātu, 1% saharozes un 1% A-agara (Sigma), garas dienas apstākļos.
GID1a cDNS, kas ievietota pDONR221 plazmā, tika rekombinēta ar pDONR P4-P1R-pUBQ10 un pDONR P2R-P3-mCherry plazmā pB7m34GW, lai ģenerētu pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNS, kas ievietota pDONR221 plazmā, tika rekombinēta ar pB7RWG266, lai ģenerētu p35S:IDD2-RFP. Lai ģenerētu pGID1b::2xmTQ2-GID1b, vispirms tika amplificēts 3,9 kb fragments augšpus GID1b kodējošā reģiona un 4,7 kb fragments, kas satur GID1b cDNS (1,3 kb) un terminatoru (3,4 kb), izmantojot 3. papildtabulā norādītos praimerus, un pēc tam ievietots attiecīgi pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) un pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) un visbeidzot rekombinēts ar pDONR221 2xmTQ268 pGreen 012567 mērķa vektorā, izmantojot Gateway klonēšanu. Lai ģenerētu pCUC2::LSSmOrange, CUC2 promotera secība (3229 bp augšpus ATG), kam seko lielā Stoksa nobīdītā mOrange (LSSmOrange)69 kodējošā secība ar N7 kodola lokalizācijas signālu un NOS transkripcijas terminatoru, tika saliktas pGreen kanamicīna mērķēšanas vektorā, izmantojot Gateway 3 fragmentu rekombinācijas sistēmu (Invitrogen). Augu binārais vektors tika ievadīts Agrobacterium tumefaciens celmā GV3101 un ievadīts Nicotiana benthamiana lapās ar Agrobacterium infiltrācijas metodi un Arabidopsis thaliana Col-0 ar ziedu iegremdēšanas metodi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry un pCLV3::mCherry-NLS qmRGA tika izolēti attiecīgi no attiecīgo krustojumu F3 un F1 pēcnācējiem.
RNS in situ hibridizācija tika veikta aptuveni 1 cm gariem dzinumu galiem72, kas tika savākti un nekavējoties fiksēti FAA šķīdumā (3,7% formaldehīds, 5% etiķskābe, 50% etanols), kas iepriekš atdzesēts līdz 4 °C. Pēc 2 × 15 minūšu vakuuma apstrādes fiksators tika nomainīts un paraugi tika inkubēti nakti. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 un RGL3 cDNS un to 3′-UTR antisensu zondes tika sintezētas, izmantojot 3. papildtabulā norādītos praimerus, kā aprakstījuši Rosier et al.73. Ar digoksigenīnu iezīmētas zondes tika imunodetektētas, izmantojot digoksigenīna antivielas (3000 reižu atšķaidījums; Roche, kataloga numurs: 11 093 274 910), un sekcijas tika iekrāsotas ar 5-brom-4-hlor-3-indolilfosfāta (BCIP, 250 reižu atšķaidījums)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 reižu atšķaidījums) šķīdumu.
Publicēšanas laiks: 2025. gada 10. februāris