Šajā pētījumā kombinētās ārstēšanas stimulējošā iedarbībaaugu augšanas regulatoriTika pētīta (2,4-D un kinetīna) un dzelzs oksīda nanodaļiņu (Fe₃O₄-NP) ietekme uz in vitro morfoģenēzi un sekundāro metabolītu veidošanos *Hypericum perforatum* L. augos. Optimizētā apstrāde [2,4-D (0,5 mg/l) + kinetīns (2 mg/l) + Fe₃O₄-NP (4 mg/l)] ievērojami uzlaboja augu augšanas parametrus: auga augstums palielinājās par 59,6%, sakņu garums par 114,0%, pumpuru skaits par 180,0% un kalusa svaigmasa par 198,3% salīdzinājumā ar kontroles grupu. Šī kombinētā apstrāde arī uzlaboja reģenerācijas efektivitāti (50,85%) un palielināja hipericīna saturu par 66,6%. GC-MS analīze atklāja augstu hiperozīda, β-patolēna un cetilspirta saturu, kas veidoja 93,36% no kopējā pīķa laukuma, savukārt kopējo fenolu un flavonoīdu saturs palielinājās pat par 80,1%. Šie rezultāti liecina, ka augu augšanas regulatori (PGR) un Fe₃O₄ nanodaļiņas (Fe₃O₄-NP) rada sinerģisku efektu, stimulējot organoģenēzi un bioaktīvo savienojumu uzkrāšanos, kas ir daudzsološa stratēģija ārstniecības augu biotehnoloģiskai uzlabošanai.
Asinszāle (Hypericum perforatum L.), kas pazīstama arī kā asinszāle, ir daudzgadīgs zālaugu augs no Hypericaceae dzimtas, kam ir ekonomiska vērtība.[1] Tās potenciālie bioaktīvie komponenti ir dabiskie tanīni, ksantoni, floroglicīns, naftalīndiantrons (hiperīns un pseidohiperīns), flavonoīdi, fenolskābes un ēteriskās eļļas.[2,3,4] Asinszāli var pavairot ar tradicionālām metodēm; tomēr tradicionālo metožu sezonalitāte, zemā sēklu dīgtspēja un uzņēmība pret slimībām ierobežo tās potenciālu liela mēroga kultivēšanai un nepārtrauktai sekundāro metabolītu veidošanai.[1,5,6]
Tādējādi audu kultūra in vitro tiek uzskatīta par efektīvu metodi ātrai augu pavairošanai, dīgļplazmas resursu saglabāšanai un ārstniecisko savienojumu ražas palielināšanai [7, 8]. Augu augšanas regulatoriem (AGR) ir izšķiroša nozīme morfoģenēzes regulēšanā, un tie ir nepieciešami kallusa un veselu organismu kultivēšanai in vitro. To koncentrāciju un kombināciju optimizācija ir ļoti svarīga šo attīstības procesu veiksmīgai pabeigšanai [9]. Tāpēc ir svarīgi izprast atbilstošu regulatoru sastāvu un koncentrāciju, lai uzlabotu asinszāles (H. perforatum) augšanu un reģenerācijas spēju [10].
Dzelzs oksīda nanodaļiņas (Fe₃O₄) ir nanodaļiņu klase, kas ir vai tiek izstrādāta audu kultūrām. Fe₃O₂ piemīt ievērojamas magnētiskās īpašības, laba bioloģiskā saderība un spēja veicināt augu augšanu un mazināt vides stresu, tāpēc tas ir piesaistījis ievērojamu uzmanību audu kultūru dizainā. Šo nanodaļiņu potenciālie pielietojumi var ietvert in vitro kultūras optimizēšanu, lai veicinātu šūnu dalīšanos, uzlabotu barības vielu uzņemšanu un aktivizētu antioksidantu enzīmus [11].
Lai gan nanodaļiņām ir pierādīta laba augu augšanu veicinoša iedarbība, pētījumi par Fe₃O₄ nanodaļiņu un optimizētu augu augšanas regulatoru kombinētu lietošanu *H. perforatum* joprojām ir nepietiekami. Lai aizpildītu šo zināšanu trūkumu, šajā pētījumā tika novērtēta to kombinētās ietekmes ietekme uz in vitro morfoģenēzi un sekundāro metabolītu veidošanos, lai sniegtu jaunas atziņas ārstniecības augu īpašību uzlabošanai. Tādēļ šim pētījumam ir divi mērķi: (1) optimizēt augu augšanas regulatoru koncentrāciju, lai efektīvi veicinātu kallusa veidošanos, dzinumu atjaunošanos un sakņošanos in vitro; un (2) novērtēt Fe₃O₄ nanodaļiņu ietekmi uz augšanas parametriem in vitro. Nākotnes plānos ietilpst reģenerēto augu izdzīvošanas rādītāju novērtēšana aklimatizācijas laikā (in vitro). Paredzams, ka šī pētījuma rezultāti ievērojami uzlabos *H. perforatum* mikropavairošanas efektivitāti, tādējādi veicinot šī svarīgā ārstniecības auga ilgtspējīgu izmantošanu un biotehnoloģisko pielietojumu.
Šajā pētījumā mēs ieguvām lapu eksplantus no laukā audzētiem viengadīgajiem asinszāles augiem (mātesaugiem). Šie eksplanti tika izmantoti, lai optimizētu in vitro kultivēšanas apstākļus. Pirms kultivēšanas lapas vairākas minūtes rūpīgi noskaloja zem tekoša destilēta ūdens. Pēc tam eksplantu virsmas dezinficēja, iegremdējot tās 70% etanolā uz 30 sekundēm, pēc tam uz 10 minūtēm iegremdējot 1,5% nātrija hipohlorīta (NaOCl) šķīdumā, kas satur dažus pilienus Tween 20. Visbeidzot, eksplantus trīs reizes noskaloja ar sterilu destilētu ūdeni, pirms pārneses uz nākamo kultivēšanas barotni.
Nākamo četru nedēļu laikā tika mērīti dzinumu reģenerācijas parametri, tostarp reģenerācijas ātrums, dzinumu skaits uz vienu eksplantu un dzinumu garums. Kad reģenerētie dzinumi sasniedza vismaz 2 cm garumu, tie tika pārvietoti uz sakņu barotni, kas sastāvēja no puskoncentrācijas MS barotnes, 0,5 mg/L indolesviestskābes (IBA) un 0,3% guāra sveķu. Sakņu kultivēšana turpinājās trīs nedēļas, kuru laikā tika mērīts sakņu ātrums, sakņu skaits un sakņu garums. Katra apstrāde tika atkārtota trīs reizes, katrā atkārtojumā kultivējot 10 eksplantus, iegūstot aptuveni 30 eksplantus katrā apstrādē.
Auga augstums tika mērīts centimetros (cm), izmantojot lineālu, no auga pamatnes līdz garākās lapas galam. Saknes garums tika mērīts milimetros (mm) tūlīt pēc rūpīgas stādu un augšanas substrāta noņemšanas. Pumpuru skaits uz katra eksplanta tika saskaitīts tieši uz katra auga. Melno plankumu, kas pazīstami kā mezgliņi, skaits uz lapām tika mērīts vizuāli. Tiek uzskatīts, ka šie melnie mezgliņi ir dziedzeri, kas satur hipericīnu, jeb oksidatīvi plankumi, un tos izmanto kā fizioloģisku indikatoru auga reakcijai uz apstrādi. Pēc visa augšanas substrāta noņemšanas stādu svaigsvars tika mērīts, izmantojot elektroniskos svarus ar precizitāti miligrami (mg).
Kallusa veidošanās ātruma aprēķināšanas metode ir šāda: pēc eksplantu kultivēšanas četru nedēļu laikā vidē, kas satur dažādus augšanas regulatorus (kināzes, 2,4-D un Fe3O4), tiek skaitīts to eksplantu skaits, kas spēj veidot kallusu. Kallusa veidošanās ātruma aprēķināšanas formula ir šāda:
Katra apstrāde tika atkārtota trīs reizes, katrā atkārtojumā pārbaudot vismaz 10 eksplantātus.
Reģenerācijas ātrums atspoguļo to kallusa audu īpatsvaru, kas veiksmīgi pabeidz pumpuru diferenciācijas procesu pēc kallusa veidošanās stadijas. Šis rādītājs parāda kallusa audu spēju pārveidoties diferencētos audos un izaugt par jauniem auga orgāniem.
Sakņošanās koeficients ir sakņoties spējīgo zaru skaita attiecība pret kopējo zaru skaitu. Šis rādītājs atspoguļo sakņošanās stadijas panākumus, kas ir ļoti svarīgi mikropavairošanā un augu pavairošanā, jo laba sakņošanās palīdz stādiem labāk izdzīvot augšanas apstākļos.
Hipericīna savienojumus ekstrahēja ar 90 % metanolu. Pie 1 ml metanola pievienoja piecdesmit mg žāvēta augu materiāla un sonikēja 20 minūtes ar frekvenci 30 kHz ultraskaņas tīrītājā (modelis A5120-3YJ) istabas temperatūrā, tumsā. Pēc sonikācijas paraugu centrifugēja ar ātrumu 6000 apgr./min 15 minūtes. Supernatantu savāca, un hipericīna absorbciju mērīja pie 592 nm, izmantojot Plus-3000 S spektrofotometru saskaņā ar Conceiçao et al. [14] aprakstīto metodi.
Lielākā daļa apstrādes ar augu augšanas regulatoriem (AGR) un dzelzs oksīda nanodaļiņām (Fe₃O₄-NP) neizraisīja melnu mezgliņu veidošanos uz reģenerētām dzinumu lapām. Nevienā no apstrādes reizēm ar 0,5 vai 1 mg/l 2,4-D, 0,5 vai 1 mg/l kinetīna vai 1, 2 vai 4 mg/l dzelzs oksīda nanodaļiņām mezgliņi netika novēroti. Dažas kombinācijas uzrādīja nelielu mezgliņu attīstības pieaugumu (bet statistiski nenozīmīgu) pie lielākām kinetīna un/vai dzelzs oksīda nanodaļiņu koncentrācijām, piemēram, 2,4-D (0,5–2 mg/l) kombinācija ar kinetīnu (1–1,5 mg/l) un dzelzs oksīda nanodaļiņām (2–4 mg/l). Šie rezultāti parādīti 2. attēlā. Melnie mezgliņi attēlo hipericīnam bagātus dziedzerus, kas ir gan dabiski sastopami, gan labvēlīgi. Šajā pētījumā melnie mezgliņi galvenokārt bija saistīti ar audu brūnēšanu, kas norāda uz labvēlīgu vidi hipericīna uzkrāšanai. Apstrāde ar 2,4-D, kinetīnu un Fe₃O₄ nanodaļiņām veicināja kallusa augšanu, samazināja brūnēšanu un palielināja hlorofila saturu, kas liecina par uzlabotu vielmaiņas funkciju un iespējamu oksidatīvo bojājumu samazināšanos [37]. Šajā pētījumā tika novērtēta kinetīna kombinācijas ar 2,4-D un Fe₃O₄ nanodaļiņām ietekme uz asinszāles kallusa augšanu un attīstību (3.a–g att.). Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka Fe₃O₄ nanodaļiņām piemīt pretsēnīšu un pretmikrobu iedarbība [38, 39], un, lietojot tās kombinācijā ar augu augšanas regulatoriem, tās var stimulēt augu aizsardzības mehānismus un samazināt šūnu stresa rādītājus [18]. Lai gan sekundāro metabolītu biosintēze ir ģenētiski regulēta, to faktiskā raža ir ļoti atkarīga no vides apstākļiem. Metaboliskās un morfoloģiskās izmaiņas var ietekmēt sekundāro metabolītu līmeni, regulējot specifisku augu gēnu ekspresiju un reaģējot uz vides faktoriem. Turklāt induktori var izraisīt jaunu gēnu aktivāciju, kas savukārt stimulē fermentatīvo aktivitāti, galu galā aktivizējot vairākus biosintēzes ceļus un novedot pie sekundāro metabolītu veidošanās. Turklāt citā pētījumā tika pierādīts, ka ēnojuma samazināšana palielina saules gaismas iedarbību, tādējādi paaugstinot dienas temperatūru *Hypericum perforatum* dabiskajā vidē, kas arī veicina hipericīna ražas palielināšanos. Pamatojoties uz šiem datiem, šajā pētījumā tika pētīta dzelzs nanodaļiņu kā potenciālu induktoru loma audu kultūrā. Rezultāti parādīja, ka šīs nanodaļiņas var aktivizēt hesperidīna biosintēzē iesaistītos gēnus, izmantojot fermentatīvu stimulāciju, kā rezultātā palielinās šī savienojuma uzkrāšanās (2. att.). Tādēļ, salīdzinot ar augiem, kas aug dabiskos apstākļos, var apgalvot, ka šādu savienojumu ražošanu in vivo var palielināt arī tad, ja mērens stress tiek apvienots ar sekundāro metabolītu biosintēzē iesaistīto gēnu aktivāciju. Kombinētām apstrādēm parasti ir pozitīva ietekme uz reģenerācijas ātrumu, bet dažos gadījumos šī ietekme ir vājināta. Jāatzīmē, ka apstrāde ar 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kināzi un dažādām koncentrācijām var neatkarīgi un ievērojami palielināt reģenerācijas ātrumu par 50,85% salīdzinājumā ar kontroles grupu (4.c att.). Šie rezultāti liecina, ka specifiskas nanohormonu kombinācijas var sinerģiski darboties, veicinot augu augšanu un metabolītu veidošanos, kam ir liela nozīme ārstniecības augu audu kultūrā. Palmer un Keller [50] parādīja, ka 2,4-D apstrāde var neatkarīgi izraisīt kallusa veidošanos St. perforatum, savukārt kināzes pievienošana ievērojami veicināja kallusa veidošanos un reģenerāciju. Šis efekts bija saistīts ar hormonālā līdzsvara uzlabošanos un šūnu dalīšanās stimulāciju. Bal et al. [51] atklāja, ka Fe₃O₄-NP apstrāde var neatkarīgi uzlabot antioksidantu enzīmu funkciju, tādējādi veicinot sakņu augšanu St. perforatum. Barotnes, kas satur Fe₃O₄ nanodaļiņas 0,5 mg/l, 1 mg/l un 1,5 mg/l koncentrācijās, uzlaboja linu augu reģenerācijas ātrumu [52]. Kinetīna, 2,4-dihlorbenzotiazolinona un Fe₃O₄ nanodaļiņu lietošana ievērojami uzlaboja kallusa un sakņu veidošanās ātrumu, tomēr jāņem vērā iespējamās blakusparādības, ko rada šo hormonu lietošana in vitro reģenerācijai. Piemēram, ilgstoša vai augstas koncentrācijas 2,4-dihlorbenzotiazolinona vai kinetīna lietošana var izraisīt somatiskas klonālas variācijas, oksidatīvo stresu, patoloģisku kallusa morfoloģiju vai vitrifikāciju. Tādēļ augsts reģenerācijas ātrums ne vienmēr paredz ģenētisko stabilitāti. Visi reģenerētie augi jānovērtē, izmantojot molekulāros marķierus (piemēram, RAPD, ISSR, AFLP) vai citoģenētisko analīzi, lai noteiktu to homogenitāti un līdzību ar in vivo augiem [53,54,55].
Šis pētījums pirmo reizi pierādīja, ka augu augšanas regulatoru (2,4-D un kinetīna) kombinēta lietošana ar Fe₃O₄ nanodaļiņām var uzlabot morfoģenēzi un galveno bioaktīvo metabolītu (tostarp hipericīna un hiperozīda) uzkrāšanos *Hypericum perforatum*. Optimizētais apstrādes režīms (1 mg/l 2,4-D + 1 mg/l kinetīna + 4 mg/l Fe₃O₄-NP) ne tikai palielināja kallusa veidošanos, organoģenēzi un sekundāro metabolītu ražu, bet arī uzrādīja vieglu inducējošu efektu, potenciāli uzlabojot auga stresa toleranci un ārstniecisko vērtību. Nanotehnoloģiju un augu audu kultūras kombinācija nodrošina ilgtspējīgu un efektīvu platformu ārstniecisku savienojumu liela mēroga in vitro ražošanai. Šie rezultāti paver ceļu rūpnieciskiem pielietojumiem un turpmākiem pētījumiem par molekulārajiem mehānismiem, devu optimizāciju un ģenētisko precizitāti, tādējādi sasaistot fundamentālos pētījumus par ārstniecības augiem ar praktisko biotehnoloģiju.
Publicēšanas laiks: 2025. gada 12. decembris