Antihelmintiskais līdzeklis N,N-dietil-m-toluamīds (DEETIr ziņots, ka tas inhibē AChE (acetilholīnesterāzi) un pārmērīgas vaskularizācijas dēļ tai ir potenciāli kancerogēnas īpašības. Šajā rakstā mēs parādām, ka DEET īpaši stimulē endotēlija šūnas, kas veicina angiogenēzi, tādējādi palielinot audzēja augšanu. DEET aktivizē šūnu procesus, kas izraisa angiogenēzi, tostarp proliferāciju, migrāciju un adhēziju. Tas ir saistīts ar palielinātu NO ražošanu un VEGF ekspresiju endotēlija šūnās. M3 klusēšana vai farmakoloģisko M3 inhibitoru lietošana atcēla visas šīs sekas, kas liecina, ka DEET izraisītā angiogēze ir jutīga pret M3. Eksperimenti, kas saistīti ar kalcija signālu pārraidi endotēlija un HEK šūnās, kas pārmērīgi ekspresē M3 receptorus, kā arī saistīšanās un dokstacijas pētījumi liecina, ka DEET darbojas kā M3 receptoru allosteriskais modulators. Turklāt DEET inhibē AChE, tādējādi palielinot acetilholīna biopieejamību un tā saistīšanos ar M3 receptoriem un pastiprinot proangiogēno iedarbību, izmantojot allosterisko regulējumu.
Primārās EC tika izolētas no Šveices peļu aortas. Ekstrakcijas metode tika pielāgota Kobajaši protokolam 26 . Peļu EC tika kultivētas EBM-2 barotnē, kas papildināta ar 5% termiski inaktivētu FBS līdz ceturtajai pasāžai.
Divu DEET koncentrāciju ietekme uz HUVEC, U87MG vai BF16F10 proliferāciju tika analizēta, izmantojot CyQUANT šūnu proliferācijas testa komplektu (Molecular Probes, C7026). Īsumā, 5, 103 šūnas katrā iedobē tika iesētas 96 iedobju plāksnē, ļāva tām piestiprināties nakti un pēc tam 24 stundas apstrādāt ar DEET. Pēc augšanas barotnes noņemšanas katrai mikroplates iedobei pievieno krāsu saistīšanas šķīdumu un inkubē šūnas 37 °C 30 minūtes. Fluorescences līmeņi tika noteikti, izmantojot Mithras LB940 daudzmodu mikroplašu lasītāju (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vācija), kas aprīkots ar 485 nm ierosmes filtriem un 530 nm emisijas filtriem.
HUVEC tika iesēti 96 bedrīšu plāksnēs ar blīvumu 104 šūnas vienā iedobē. Šūnas 24 stundas apstrādāja ar DEET. Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, izmantojot kolorimetrisko MTT testu (Sigma-Aldrich, M5655). Optiskā blīvuma vērtības tika iegūtas ar daudzmodu mikroplašu lasītāju (Mithras LB940) pie viļņa garuma 570 nm.
DEET iedarbība tika pētīta, izmantojot in vitro angiogēzes testus. Ārstēšana ar 10-8 M vai 10-5 M DEET palielināja kapilāru garuma veidošanos HUVEC (1.a, b att., baltas joslas). Salīdzinot ar kontroles grupu, ārstēšana ar DEET koncentrāciju diapazonā no 10-14 līdz 10-5 M parādīja, ka kapilāra garums sasniedza plato pie 10-8 M DEET (papildu attēls S2). Netika konstatēta būtiska atšķirība in vitro proangiogēnajā iedarbībā HUVEC, kas apstrādāti ar DEET koncentrāciju diapazonā no 10-8 M un 10-5 M.
Lai noteiktu DEET ietekmi uz neovaskularizāciju, mēs veicām in vivo neovaskularizācijas pētījumus. Pēc 14 dienām pelēm, kurām injicētas endotēlija šūnas, kas iepriekš kultivētas ar 10-8 M vai 10-5 M DEET, tika konstatēts ievērojams hemoglobīna satura pieaugums (1.c attēls, baltas joslas).
Turklāt DEET izraisīta neovaskularizācija tika pētīta pelēm ar U87MG ksenotransplantātu, kurām katru dienu (ip) injicēja DEET devā, par kuru zināms, ka tā izraisa plazmas koncentrāciju 10–5 M, kas ir normāli iedarbībai pakļautiem cilvēkiem. 23. Nosakāmi audzēji (ti, audzēji >100 mm3) tika novēroti 14 dienas pēc U87MG šūnu injekcijas pelēm. 28. dienā audzēja augšana ievērojami pastiprinājās ar DEET ārstētām pelēm, salīdzinot ar kontroles pelēm (1.d attēls, kvadrāti). Turklāt audzēju iekrāsošana ar CD31 parādīja, ka DEET ievērojami palielināja kapilāru laukumu, bet ne mikrovaskulāru blīvumu. (1.e–g att.).
Lai noteiktu muskarīna receptoru lomu DETA izraisītā proliferācijā, tika izmantota 10-8 M vai 10-5 M DETA pFHHSiD (10-7 M, selektīvs M3 receptoru antagonists) klātbūtnē. HUVEC ārstēšana. pFHHSiD pilnībā bloķēja DETA proliferatīvās īpašības visās koncentrācijās (1.
Šajos apstākļos mēs arī pārbaudījām, vai DEET palielinātu kapilāru garumu HUVEC šūnās. Tāpat pFHHSiD būtiski novērsa DEET izraisīto kapilāru garumu (1.a, b att., pelēkās joslas). Turklāt līdzīgi eksperimenti tika veikti ar M3 siRNS. Lai gan kontroles siRNS nebija efektīva kapilāru veidošanās veicināšanā, M3 muskarīna receptoru klusēšana atcēla DEET spēju palielināt kapilāru garumu (1.a, b att., melnās joslas).
Turklāt pFHHSiD pilnībā bloķēja gan 10-8 M vai 10-5 M DEET izraisītu vaskularizāciju in vitro, gan neovaskularizāciju in vivo (1.c, d, apļi). Šie rezultāti liecina, ka DEET veicina angiogenēzi, izmantojot ceļu, kas ir jutīgs pret selektīviem M3 receptoru antagonistiem vai M3 siRNS.
AChE ir DEET molekulārais mērķis. Tādas zāles kā donepezils, kas darbojas kā AChE inhibitori, var stimulēt EK angiogenēzi in vitro un peles pakaļējo ekstremitāšu išēmijas modeļos14. Mēs pārbaudījām divu DEET koncentrāciju ietekmi uz AChE enzīmu aktivitāti HUVEC. Zema (10-8 M) un augsta (10-5 M) DEET koncentrācija samazināja endotēlija AChE aktivitāti salīdzinājumā ar kontroles apstākļiem (2. att.).
Abas DEET koncentrācijas (10-8 M un 10-5 M) samazināja acetilholīnesterāzes aktivitāti uz HUVEC. BW284c51 (10–5 M) tika izmantots kā acetilholīnesterāzes inhibitoru kontrole. Rezultāti ir izteikti procentos no AChE aktivitātes HUVEC, kas apstrādāts ar divām DEET koncentrācijām, salīdzinot ar šūnām, kas apstrādātas ar nesēju. Vērtības ir izteiktas kā sešu neatkarīgu eksperimentu vidējais ± SEM. *p < 0,05, salīdzinot ar kontroli (Kruskal-Wallis un Dunn vairākkārtējs salīdzināšanas tests).
Slāpekļa oksīds (NO) ir iesaistīts angiogēnajā procesā 33, tāpēc tika pētīta NO veidošanās DEET stimulētos HUVEC. Ar DEET apstrādātā endotēlija NO ražošana palielinājās, salīdzinot ar kontroles šūnām, bet sasniedza nozīmīgumu tikai pie 10-8 M devas (3.c attēls). Lai noteiktu molekulārās izmaiņas, kas kontrolē DEET izraisītu NO ražošanu, eNOS ekspresija un aktivācija tika analizēta ar Western blot metodi. Lai gan ārstēšana ar DEET nemainīja eNOS ekspresiju, tā ievērojami palielināja eNOS fosforilāciju tās aktivācijas vietā (Ser-1177), vienlaikus samazinot tās inhibējošo vietu (Thr-495), salīdzinot ar neapstrādātām šūnām eNOS fosforilācijā (3.d attēls). Turklāt fosforilētā eNOS attiecība aktivācijas vietā un inhibējošā vietā tika aprēķināta pēc fosforilētā eNOS daudzuma normalizēšanas pret kopējo fermenta daudzumu. Šī attiecība bija ievērojami palielināta HUVEC, kas tika ārstēti ar katru DEET koncentrāciju, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām (3.d attēls).
Visbeidzot, VEGF, kas ir viens no galvenajiem proangiogēnajiem faktoriem, ekspresija tika analizēta ar Western blotēšanu. DEET ievērojami palielināja VEGF ekspresiju, savukārt pFHHSiD pilnībā bloķēja šo ekspresiju .
Tā kā DEET iedarbība ir jutīga gan pret M3 receptoru farmakoloģisko blokādi, gan pazeminātu regulēšanu, mēs pārbaudījām hipotēzi, ka DEET varētu uzlabot kalcija signālu pārraidi. Pārsteidzoši, ka DEET neizdevās palielināt citoplazmas kalcija līmeni HUVEC (dati nav parādīti) un HEK/M3 (att. 4a, b) abām izmantotajām koncentrācijām.
Izlikšanas laiks: 30. decembris 2024