Antihelmintiskais līdzeklis N,N-dietil-m-toluamīds (DEET) ir ziņots, ka tas inhibē AChE (acetilholīnesterāzi) un tam piemīt potenciāli kancerogēnas īpašības pārmērīgas vaskularizācijas dēļ. Šajā rakstā mēs parādām, ka DEET specifiski stimulē endotēlija šūnas, kas veicina angioģenēzi, tādējādi palielinot audzēja augšanu. DEET aktivizē šūnu procesus, kas noved pie angioģenēzes, tostarp proliferācijas, migrācijas un adhēzijas. Tas ir saistīts ar palielinātu NO veidošanos un VEGF ekspresiju endotēlija šūnās. M3 apklusināšana vai farmakoloģisku M3 inhibitoru lietošana likvidēja visas šīs sekas, kas liecina, ka DEET inducētā angioģenēze ir jutīga pret M3. Eksperimenti, kas ietver kalcija signalizāciju endotēlija un HEK šūnās, kas pārmērīgi ekspresē M3 receptorus, kā arī saistīšanās un dokošanas pētījumi liecina, ka DEET darbojas kā M3 receptoru alosteriskais modulators. Turklāt DEET inhibē AChE, tādējādi palielinot acetilholīna biopieejamību un tā saistīšanos ar M3 receptoriem, un pastiprinot proangiogēnisko iedarbību, izmantojot alosterisku regulāciju.
Primārās endokrīnās šūnas (EC) tika izolētas no Šveices peļu aortas. Ekstrakcijas metode tika pielāgota no Kobajaši protokola26. Peļu EC tika kultivētas EBM-2 vidē, kas papildināta ar 5% termiski inaktivētas FBS, līdz ceturtajai pasāžai.
Divu DEET koncentrāciju ietekme uz HUVEC, U87MG vai BF16F10 proliferāciju tika analizēta, izmantojot CyQUANT šūnu proliferācijas testa komplektu (Molecular Probes, C7026). Īsumā, 96 iedobju plāksnē tika iesētas 5,103 šūnas katrā iedobē, ļauts piestiprināties nakti un pēc tam apstrādātas ar DEET 24 stundas. Pēc augšanas barotnes noņemšanas katrā mikroplašu iedobē pievieno krāsvielu saistošu šķīdumu un šūnas inkubē 37 °C temperatūrā 30 minūtes. Fluorescences līmeņi tika noteikti, izmantojot Mithras LB940 daudzmodu mikroplašu lasītāju (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Vācija), kas aprīkots ar 485 nm ierosmes filtriem un 530 nm emisijas filtriem.
HUVEC šūnas tika iesētas 96 iedobumu plāksnēs ar blīvumu 104 šūnas katrā iedobē. Šūnas 24 stundas tika apstrādātas ar DEET. Šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, izmantojot kolorimetrisko MTT testu (Sigma-Aldrich, M5655). Optiskā blīvuma vērtības tika iegūtas, izmantojot daudzmodu mikroplašu lasītāju (Mithras LB940) pie viļņa garuma 570 nm.
DEET ietekme tika pētīta, izmantojot in vitro angioģenēzes testus. Apstrāde ar 10-8 M vai 10-5 M DEET palielināja kapilāru garuma veidošanos HUVEC (1.a, b att., baltās joslas). Salīdzinot ar kontroles grupu, apstrāde ar DEET koncentrācijām no 10-14 līdz 10-5 M parādīja, ka kapilāru garums sasniedza plato pie 10-8 M DEET (2. papildattēls). Netika konstatēta būtiska atšķirība HUVEC in vitro proangiogēniskajā efektā, kas tika apstrādāti ar DEET koncentrācijas diapazonā no 10-8 M un 10-5 M.
Lai noteiktu DEET ietekmi uz neovaskularizāciju, veicām neovaskularizācijas pētījumus in vivo. Pēc 14 dienām pelēm, kurām injicēja endotēlija šūnas, kas iepriekš kultivētas ar 10-8 M vai 10-5 M DEET, tika novērots ievērojams hemoglobīna satura pieaugums (1.c attēls, baltās joslas).
Turklāt DEET izraisīta neovaskularizācija tika pētīta pelēm ar U87MG ksenotransplantātiem, kurām katru dienu (ip) injicēja DEET devā, kas, kā zināms, izraisa 10-5 M koncentrāciju plazmā, kas ir normāla iedarbībai pakļautiem cilvēkiem. 23 pētījumā. Konstatējami audzēji (t. i., audzēji >100 mm3) tika novēroti 14 dienas pēc U87MG šūnu injekcijas pelēm. 28. dienā audzēja augšana bija ievērojami palielināta ar DEET ārstētām pelēm, salīdzinot ar kontroles pelēm (1. att., kvadrāti). Turklāt audzēju CD31 krāsošana parādīja, ka DEET ievērojami palielināja kapilāru laukumu, bet ne mikrovadu blīvumu. (1. att. e–g).
Lai noteiktu muskarīna receptoru lomu DETA inducētā proliferācijā, tika izmantota 10-8 M vai 10-5 M DETA pFHHSiD (10-7 M, selektīvs M3 receptoru antagonists) klātbūtnē. HUVEC apstrāde. pFHHSiD pilnībā bloķēja DETA proliferatīvās īpašības visās koncentrācijās (1. tabula).
Šādos apstākļos mēs arī pārbaudījām, vai DEET palielinātu kapilāru garumu HUVEC šūnās. Līdzīgi pFHHSiD būtiski novērsa DEET izraisīto kapilāru garumu (1.a, b att., pelēkie stabiņi). Turklāt līdzīgi eksperimenti tika veikti ar M3 siRNS. Lai gan kontroles siRNS nebija efektīvs kapilāru veidošanās veicināšanā, M3 muskarīna receptora apklusināšana likvidēja DEET spēju palielināt kapilāru garumu (1.a, b att., melnie stabiņi).
Turklāt gan 10-8 M, gan 10-5 M DEET inducētā vaskularizācija in vitro, gan neovaskularizācija in vivo tika pilnībā bloķēta ar pFHHSiD (1.c, d att., apļi). Šie rezultāti liecina, ka DEET veicina angioģenēzi caur ceļu, kas ir jutīgs pret selektīviem M3 receptoru antagonistiem vai M3 siRNS.
AChE ir DEET molekulārais mērķis. Tādas zāles kā donepezils, kas darbojas kā AChE inhibitori, var stimulēt endotēlija angioģenēzi in vitro un peļu pakaļkāju išēmijas modeļos14. Mēs pārbaudījām divu DEET koncentrāciju ietekmi uz AChE enzīma aktivitāti HUVEC. Zema (10-8 M) un augsta (10-5 M) DEET koncentrācija samazināja endotēlija AChE aktivitāti salīdzinājumā ar kontroles apstākļiem (2. att.).
Abas DEET koncentrācijas (10-8 M un 10-5 M) samazināja acetilholīnesterāzes aktivitāti uz HUVEC. BW284c51 (10-5 M) tika izmantots kā acetilholīnesterāzes inhibitoru kontrole. Rezultāti ir izteikti kā AChE aktivitātes procentuālā daļa uz HUVEC, kas apstrādāti ar divām DEET koncentrācijām, salīdzinot ar ar nesējvielu apstrādātām šūnām. Vērtības ir izteiktas kā sešu neatkarīgu eksperimentu vidējais rādītājs ± SEM. *p < 0,05, salīdzinot ar kontroli (Kruskal-Wallis un Dunn daudzkārtējo salīdzināšanas tests).
Slāpekļa oksīds (NO) ir iesaistīts angioģenēzes procesā,33 tāpēc tika pētīta NO veidošanās DEET stimulētās HUVEC šūnās. Ar DEET apstrādātā endotēlija NO veidošanās bija palielināta, salīdzinot ar kontroles šūnām, bet sasniedza nozīmīgumu tikai pie devas 10-8 M (3.c att.). Lai noteiktu molekulārās izmaiņas, kas kontrolē DEET inducēto NO veidošanos, eNOS ekspresija un aktivācija tika analizēta ar Western blotēšanu. Lai gan DEET apstrāde nemainīja eNOS ekspresiju, tā ievērojami palielināja eNOS fosforilēšanos tā aktivācijas vietā (Ser-1177), vienlaikus samazinot tā inhibīcijas vietu (Thr-495), salīdzinot ar neapstrādātām šūnām eNOS fosforilēšanā (3.d att.). Turklāt fosforilētā eNOS attiecība aktivācijas vietā un inhibīcijas vietā tika aprēķināta pēc fosforilētā eNOS daudzuma normalizēšanas pret kopējo enzīma daudzumu. Šī attiecība bija ievērojami palielināta HUVEC šūnās, kas tika apstrādātas ar katru DEET koncentrāciju, salīdzinot ar neapstrādātām šūnām (3.d att.).
Visbeidzot, VEGF, viena no galvenajiem proangiogēniskajiem faktoriem, ekspresija tika analizēta ar Western blotēšanu. DEET būtiski palielināja VEGF ekspresiju, savukārt pFHHSiD pilnībā bloķēja šo ekspresiju.
Tā kā DEET iedarbība ir jutīga gan pret M3 receptoru farmakoloģisko blokādi, gan regulācijas samazināšanos, mēs pārbaudījām hipotēzi, ka DEET varētu pastiprināt kalcija signālu pārraidi. Pārsteidzoši, ka DEET nepalielināja citoplazmas kalcija līmeni HUVEC (dati nav parādīti) un HEK/M3 (4.a, b att.) nevienā no izmantotajām koncentrācijām.
Publicēšanas laiks: 2024. gada 30. decembris