Pesticīdiem ir izšķiroša nozīme globālā pārtikas trūkuma risināšanā un cīņā pret vektoru pārnēsātām cilvēku slimībām. Tomēr pieaugošā pesticīdu rezistences problēma steidzami prasa atklāt jaunus savienojumus, kas vērsti uz nepietiekami izmantotiem mērķiem. Kukaiņu pārejas receptoru potenciāla (TRPV) kanāli — Nanzhong (Nan) un neaktīvie (Iav) — var veidot heterologus kanālus (Nan-Iav) un lokalizēties mehānosensoros orgānos, kas mediē geotropismu, dzirdi un propriocepciju kukaiņos. Daži pesticīdi, piemēram, afidopirolidons (AP), iedarbojas uz Nan-Iav, izmantojot nezināmus mehānismus. AP ir efektīvs pret caururbjošiem-sūcošiem kukaiņiem (hemipterāniem), novēršot barošanos, traucējot pavedienu funkciju. AP var saistīties tikai ar Nan, bet tikai Nan-Iav var mijiedarboties ar agonistiem, tostarp endogēno nikotīnamīdu (NAM), tādējādi demonstrējot kanālu aktivitāti. Neskatoties uz Nan-Iav potenciālu kā insekticīda mērķi, par tā kanālu konstrukciju, regulējošajām saistīšanās vietām un Ca2+ atkarīgo regulāciju ir maz zināms, kas kavē turpmāku insekticīdu izstrādi. Šajā pētījumā krioelektronu mikroskopija tika izmantota, lai noteiktu Nan-Iav struktūru Hemiptera kukaiņos kalmodulīna-liganda brīvā stāvoklī, kā arī ar AP un NAM ankirīna atkārtojuma citoplazmatiskā domēna (ARD) robežās. Pārsteidzoši, mēs atklājām, ka pats Nan proteīns var veidot pentamēru, ko stabilizē AP mediētas ARD mijiedarbības. Šis pētījums atklāj molekulāro mijiedarbību starp insekticīdiem un agonistiem un Nan-Iav, izceļot ARD nozīmi kanālu funkcijā un montāžā, un izpētot Ca2+ regulācijas mehānismu.
Uz arvien smagāku globālo klimata pārmaiņu fona globālā pārtikas nodrošinājuma pasliktināšanās ir viena no lielākajām 21. gadsimta problēmām, kam ir lavīnveida sekas sabiedrībai.1,2Pasaules Veselības organizācijas ziņojumā “Pārtikas nodrošinājuma un uztura stāvoklis pasaulē 2023. gadā” (SOFI) lēsts, ka aptuveni 2,33 miljardi cilvēku visā pasaulē cieš no mērenas vai smagas pārtikas nepietiekamības, kas ir ilgstoša problēma.3,4Diemžēl tiek lēsts, ka kaitēkļu un patogēnu dēļ katru gadu tiek zaudēti aptuveni 20–30 % vai vairāk kultūraugu ražas, un tiek prognozēts, ka globālā sasilšana saasinās kaitēkļu izturību un kultūraugu ievainojamību.4, 5, 6, 7, 8Pesticīdu izstrāde ir kritiski svarīga ne tikai, lai aizsargātu kultūraugus no kaitēkļiem un samazinātu vektoru pārnēsātu patogēnu izplatību, bet arī lai apkarotu vektoru pārnēsātas cilvēku slimības, piemēram, denges drudzi, malāriju un Čagasa slimību, kas arvien vairāk kļūst izturīgas pret pesticīdiem.5, 9, 10, 11
Starp galvenajiem neirotoksisko insekticīdu mērķiem heterotetrameriskais TRPV kanāls Nanchung (Nan) -Inactive (Iav) pārstāv insekticīdu mērķu klasi, kas atklāta tikai pēdējā desmitgadē, tostarp komerciāli pieejami insekticīdi, piemēram, imidakloprīds un piraklostrobīns.12, 13, 14Pussintētiskais insekticīds apidopirolifēns (AP) ir nesen izstrādāts un komercializēts produkts, kura galvenā sastāvdaļa ir aktīvais insekticīds Inscalis®, kas saistās ar AP subnanomolārā aktivitātes līmenī.15AP uzrāda zemu akūtu toksicitāti apputeksnētājiem, derīgajiem kukaiņiem un citiem nemērķa organismiem, un, lietojot saskaņā ar norādījumiem uz etiķetes, tas var samazināt rezistences spiedienu pret citiem insekticīdiem.16, 17, 18Nan un Iav ir plaši izplatīti starp kukaiņu sugām, tiek ekspresēti tikai antenu un ekstremitāšu hordalās stiepšanās receptoru neironos un ir kritiski svarīgi dzirdei, gravitācijas uztverei un propriocepcijai.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, imidakloprīds un piraklostrobīns stimulē Nan-Iav kompleksu, izmantojot unikālu mehānismu, galu galā kavējot proprioceptīvo signālu pārvadi.13, 16, 23Kukaiņiem, kas sūc dūrienus (hemipterāni), piemēram, laputīm un baltajām mušiņām, propriocepcijas zudums pasliktina to barošanās spējas, galu galā izraisot nāvi.13,24Interesanti, ka AP uzrāda augstu afinitāti pret Nan-Iav kompleksu un zemu afinitāti pret Nan vienu pašu. AP saistīšanās ar Nan-Iav inducē elektrisko strāvu, bet saistīšanās tikai ar Nan nestimulē kanāla aktivitāti. Pats Iav vispār nesaistās ar AP.16Tas liek domāt, ka Nan un Iav var saistīties, veidojot dažādus Nan-Iav kanālu kompleksus (piemēram, ar dažādām stehiometriskām attiecībām vai atšķirīgu izkārtojumu vienā un tajā pašā stehiometriskajā attiecībā), vai arī ka AP var saistīties ar vairākām vietām. Turklāt dabiskais agonists nikotīnamīds (NAM) saistās ar Drosophila Nan-Iav ar mikromolāru afinitāti, uzrādot līdzīgu iedarbību kā laputīm (AP) in vitro.16,25un kavē laputu vairošanos un barošanos, galu galā izraisot to nāvi25,26Šie dati rada daudz jautājumu. Piemēram, joprojām nav skaidrs, kā veidojas Nan-Iav heterodimērs, kuras saistīšanās vietas tiek izmantotas mazo molekulu modulēšanai un kā šīs mazās molekulas regulē kanālu funkciju, nomācot propriocepciju. Turklāt joprojām nav skaidrs, kāpēc pats Nan ir neaktīvs un tam ir zema afinitāte pret AP, savukārt Nan-Iav heterodimērs ir aktīvs un saistās ar AP ar lielāku afinitāti. Visbeidzot, maz ir zināms par Nan-Iav funkcijas Ca2+ atkarīgo regulāciju un to, kā tā ir integrēta neironu signalizācijas procesos.13,21
Šajā pētījumā, apvienojot krioelektronu mikroskopijas, elektrofizioloģijas un radioligandu saistīšanas metodes, mēs noskaidrojām Nan-Iav veidošanos un tā saistīšanās mehānismu ar mazo molekulu regulatoriem. Turklāt mēs atklājām konstitutīvi saistītu kalmodulīnu (CaM) ar Iav un ar AP stabilizētus Nan pentamērus. Šie rezultāti sniedz svarīgu ieskatu kalcija jonu regulācijā kanālos, kanālu veidošanā un faktoros, kas nosaka ligandu saistīšanās afinitāti. Vēl svarīgāk, mēs apstiprinājām, ka ARD spēlē centrālu lomu šajos procesos. Mūsu pētījums par pilniem kukaiņu kanāliem, kas saistīti ar attiecīgajiem lauksaimniecības pesticīdiem.27., 28., 29.paver perspektīvas pesticīdu nozares attīstībai, uzlabojot pesticīdu efektivitāti un specifiskumu, kā arī ļaujot TRPV mērķtiecīgi iedarboties uz citām sugām, lai risinātu globālās pārtikas nodrošinājuma problēmas un ierobežotu vektoru pārnēsātu slimību izplatību.
Mēs arī atklājām, ka Nan-Iav regulē Ca2+, un regulēšanas mehānismu nodrošina konstitutīvi saistīts CaM. Svarīgi ir tas, ka šī Ca2+ atkarīgā Nav regulācija ar CaM būtiski atšķiras no citu jonu kanālu (piemēram, spriegumam jutīgo Na+ kanālu un TRPV5/6 kanālu) regulēšanas mehānismiem.52, 53, 54, 55, 56, 57Nav1.2 kanālā CaM C-termināla domēns spirālveidīgi saistās ar C-termināla domēnu (CTD), un Ca2+ inducē tā N-termināla domēna saistīšanos ar CTD distālo daļu.56TRPV5/6 kanālā CaM C-terminālais domēns saistās ar CTH, un Ca2+ inducē tā N-terminālā domēna pagarināšanos porās, tādējādi bloķējot katjonu caurlaidību.53,54Mēs piedāvājam modeli Nan-Iav-CaM Ca2+ regulētai funkcijai (4.h att.). Šajā modelī CaM N-terminālais domēns konstitutīvi saistās ar Iav C-terminālo domēnu (CTH). Miera stāvoklī (zema [Ca2+] koncentrācija) CaM C-terminālais domēns mijiedarbojas ar Nan, stabilizējot ARD konformāciju un tādējādi veicinot kanāla atvēršanos. Agonista/insekticīda saistīšanās ar kanālu izraisa poru atvēršanos, kas noved pie Ca2+ pieplūduma. Pēc tam Ca2+ saistās ar CaM, izraisot C-terminālā domēna disociāciju no Nan ARD. Tā kā CaM saistīšanās bloķēšana būtībā novērš Ca2+ inhibējošo efektu, šī disociācija modulē ARD mobilitāti, tādējādi izraisot Ca2+ atkarīgu inhibīciju vai desensitizāciju. Kanāla strāvu straujā atjaunošanās pēc kalcija jonu eluācijas (4.g att.) liecina, ka šis mehānisms veicina ātru reakciju uz Ca2+ mediētiem neironu signāliem. Turklāt ziņots, ka Iav C-termināla reģions, kas joprojām ir vāji izpētīts, spēlē arī citas lomas kanālu mērķēšanā un strāvas regulēšanā.21
Visbeidzot, mūsu pētījumā ir sniegta lauksaimnieciski nozīmīga insekticīda-insekticīda TRP kanāla kompleksa augstas izšķirtspējas struktūra — atklājums, kas mums iepriekš nebija zināms. Jāatzīmē, ka mēs raksturojām kukaiņu kanāla struktūru un funkciju cilvēka šūnās (HEK293S GnTi–), nevis kukaiņu šūnās. Ņemot vērā pieaugošo insekticīdu rezistenci un pastāvīgo spiedienu uz pārtikas nodrošinājumu un patogēniem, mūsu darbs sniedz svarīgu informāciju, kas atvieglos jaunu insekticīdu izstrādi cilvēku veselības un globālās pārtikas nodrošinājuma labā. Pētījumi ir parādījuši, ka tādi insekticīdi kā AP ir efektīvi pret dažiem kaitēkļiem, ja tos lieto saskaņā ar norādījumiem uz etiķetes, un tiem ir zema akūta toksicitāte labvēlīgajiem apputeksnētājiem, kas pierāda to drošību pret vidi.13,16Turklāt dažu AP atvasinājumu testēšana uz odiem ir parādījusi, ka tie galu galā zaudē spēju lidot. Izpratne par to, kā šie modulējošie savienojumi saistās ar Nan-Iav, atvieglos esošo savienojumu modificēšanu vai jaunu savienojumu izstrādi efektīvākiem unprecīzskaitēkļu apkarošana. Mūsu pētījums parāda, ka Nan-Iav ARD saskarne ir kritiski svarīga ne tikai endogēno savienojumu, pesticīdu un Ca2+-CaM aktivitātes regulēšanai, bet arī kanālu montāžai. Mēs iesakām, ka heterodimēru montāžas pārtraukšana ar mazām molekulām varētu būt unikāla un daudzsološa pieeja jonu kanālu inhibitoru izstrādei.
No astoņiem ortologiem gēniem tika atlasīti brūnās vaboles (Halyomorpha halys) pilna garuma gēni Nanchung un Inactive, kas uzrādīja izcilu stabilitāti mazgāšanas līdzekļos. Sintezētie gēni tika kodonu ziņā optimizēti cilvēka ekspresijai un klonēti pBacMam pCMV-DEST vektorā (Life Technologies), izmantojot XhoI un EcoRI restrikcijas vietas. Tas nodrošināja, ka kloni atradās rāmī ar C-termināla GFP-FLAG-10xHis un mCherry-FLAG-10xHis tagiem, kurus šķeļ HRC-3C proteāze (PPX), ļaujot neatkarīgiemizteiksmeNanchung un Inactive klonēšanai pBacMam vektorā tika izmantoti šādi primeri:
Atsevišķu daļiņu mikroskopiskie attēli tika iegūti, izmantojot Titan Krios G2 transmisijas elektronu mikroskopu (FEI), kas aprīkots ar K3 kameru un Gatan BioQuantum enerģijas filtru. Mikroskops darbojās ar spriegumu 300 keV, enerģijas iestatījumu 20 eV, parauga pikseļa izmēru 1,08 Å/pikselis (nominālais palielinājums 81 000x) un defokusēšanas gradientu no -0,8 līdz -2,2 μm. Videoieraksts tika veikts ar ātrumu 40 kadri sekundē, izmantojot Latitude S mikroskopu (Gatan) ar nominālo devas ātrumu 25 e–px−1 s−1, ekspozīcijas laiku 2,4 s un kopējo devu aptuveni 60 e–Å−2.
Stara izraisītas kustības korekcija un devas svēršana tika veikta uz filmas, izmantojot MotionCor2 programmā RELION 4.061. Kontrasta pārneses funkcijas (CTF) parametru novērtēšana tika veikta programmā cryoSPARC, izmantojot uz ielāpiem balstītu CTF novērtēšanas metodi62. Fotomikrogrāfi ar CTF pielāgošanas izšķirtspēju ≥4 Å tika izslēgti no turpmākās analīzes. Parasti punktu atlasei cryoSPARC tika izmantota 500–1000 fotomikrogrāfu apakškopa, kam sekoja vairākas 2D klasifikācijas kārtas pēc filtrēšanas, lai iegūtu skaidru atsauces attēlu uz veidnes balstītai daļiņu atlasei. Pēc tam daļiņas tika ekstrahētas, izmantojot 64 pikseļu ierobežojošos lodziņus un 4 reizes grupēšanu. Tika veiktas vairākas 2D klasifikācijas kārtas, lai noņemtu nevēlamas daļiņu kategorijas. Sākotnējais 3D modelis tika rekonstruēts, izmantojot ab initio rekonstrukciju, un precizēts, izmantojot nevienmērīgu precizēšanu programmā cryoSPARC. 3D klasifikācija tika veikta programmā cryoSPARC vai RELION, pamatojoties uz ARD heterogenitāti. Netika novērota būtiska membrānas domēnu heterogenitāte. Daļiņas tika precizētas, izmantojot C1 un C2 metodes; Daļiņas ar augstāku C2 izšķirtspēju tika uzskatītas par simetriskām attiecībā pret C2 un importētas programmā RELION, lai veiktu Beijesa precizēšanu. Pēc tam daļiņas tika pārvietotas atpakaļ uz cryoSPARC, lai veiktu galīgo nevienmērīgo un lokālo precizēšanu. Galīgā izšķirtspēja un daļiņu skaits ir parādīts 1. tabulā.
Apstrādājot Nan+AP pentamērus, mēs izpētījām dažādas metodes membrānas domēnu (īpaši poru reģiona) izšķirtspējas uzlabošanai, piemēram, signāla atņemšanu un TMD maskēšanu. Tomēr šie mēģinājumi bija neveiksmīgi potenciāli ārkārtējās poru reģiona nesakārtotības un TMD kopējās heterogenitātes dēļ. Galīgā izšķirtspēja tika aprēķināta, izmantojot masku, ko automātiski ģenerēja nevienmērīgās apstrādes metode cryoSPARC, galvenokārt koncentrējoties uz ARD reģionu. Tādējādi tika panākta ievērojami augstāka izšķirtspēja nekā membrānas domēniem (īpaši VSLD reģionam).
Sākotnējie Nančunas un neaktīvo baktēriju apo formu de novo modeļi vispirms tika ģenerēti, izmantojot Coot63, un Nan un Iav baktēriju modeļi tika ģenerēti, izmantojot AlphaFold264, lai identificētu zemas ticamības reģionus. Kalmodulīna modelēšana tika balstīta uz Ca2+ saistošo un Ca2+ brīvo modeļu stingra ķermeņa aproksimācijām PDB piekļuves punktos attiecīgi 4JPZ56 un 1CFD65. Modeļi tika precizēti, izmantojot sfērisku precizēšanu, lai nodrošinātu pareizu stereoķīmiju un labu ģeometriju. Pēc tam fosfatidilholīns, fosfatidiletanolamīns un fosfatidilserīns tika modelēti kā precīzi definēti lipīdu blīvumi, un NAM un AP ligandi tika ievietoti atbilstošajos blīvumos ciešajās savienojumos. Ierobežojumu faili tika ģenerēti no izoformu SMILES virknes, izmantojot eLBOW PHENIX66. Visbeidzot, modeļi tika precizēti reālā telpā PHENIX, izmantojot lokālo režģa meklēšanu un globālo minimizāciju ar sekundārās struktūras ierobežojumiem. Modeļa precizēšanai un strukturālajai analīzei tika izmantots MolProbity serveris, un ilustrācijas tika veiktas, izmantojot PyMOL un UCSF Chimera X.67,68,69 Apertūras analīze tika veikta, izmantojot HOLE serveri,70 un secības saglabāšanas kartēšana tika veikta, izmantojot Consurf serveri.71
Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot Igor Pro 6.2, Excel Office 365 un GraphPad Prism 7.0. Visi kvantitatīvie dati ir norādīti kā vidējais rādītājs ± standarta kļūda (SEM). Divu grupu salīdzināšanai tika izmantots Stjudenta t-tests (divpusējs, nepāra). Vairāku grupu salīdzināšanai tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA), kam sekoja Daneta post hoc tests. *P< 0,05, **P< 0,01 un ***P< 0,001 tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām atkarībā no datu sadalījuma. Kd, Ki vērtības un to asimetriskie 95% ticamības intervāli tika aprēķināti, izmantojot GraphPad Prism 10.
Sīkāku informāciju par pētījuma metodoloģiju skatiet šajā rakstā pievienotajā Dabas portfeļa ziņojuma kopsavilkumā.
Sākotnējais modelis tika izveidots, izmantojot kalmodulīna modeļus no PDB 4JPZ un 1CFD datubāzēm. Koordinātas ir deponētas Olbaltumvielu datu bankā (PDB) ar piekļuves numuriem 9NVN (Nan-Iav-CaM bez liganda), 9NVO (Nan-Iav-CaM saistīts ar nikotīnamīdu), 9NVP (Nan-Iav-CaM saistīts ar nikotīnamīdu un EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM saistīts ar afenidolpirolīnu un kalciju), 9NVR (Nan-Iav-CaM saistīts ar afenidolpirolīnu un EDTA) un 9NVS (Nan pentamērs saistīts ar afenidolpirolīnu). Atbilstošie krioelektronu mikroskopijas attēli ir deponēti elektronu mikroskopijas datubāzē (EMDB) ar šādiem piekļuves numuriem: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM bez liganda), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM komplekss ar nikotīnamīdu), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM komplekss ar nikotīnamīdu un EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM komplekss ar afidopirolīnu un kalciju), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM komplekss ar afidopirolīnu un EDTA) un EMD-49849 (Nan pentamēra komplekss ar afidopirolīnu). Šajā rakstā ir sniegti funkcionālās analīzes neapstrādātie dati.
Publicēšanas laiks: 2026. gada 28. janvāris