Augu un patogēnu materiāli
Sorgo asociācijas kartēšanas populāciju, kas pazīstama kā sorgo konversijas populācija (SCP), nodrošināja Dr. Pets Brauns no Ilinoisas Universitātes (tagad Kalifornijas Universitātē Deivisā). Tā ir aprakstīta iepriekš, un tā ir dažādu līniju kolekcija, kas pārveidotas par fotoperioda nejutīgām un mazāka auguma, lai veicinātu augu augšanu un attīstību ASV vidē. Šajā pētījumā tika izmantotas 510 līnijas no šīs populācijas, lai gan sliktas dīgtspējas un citu kvalitātes kontroles problēmu dēļ ne visas līnijas tika izmantotas visu trīs pazīmju analīzē. Galu galā dati no 345 līnijām tika izmantoti hitīna atbildes analīzei, 472 līnijas - flg22 atbildes analīzei un 456 līnijas - TLS rezistences analīzei.B. cookeiLSLP18 celms tika iegūts no Dr. Burta Blūma Arkanzasas Universitātē.
MAMP atbildes mērīšana
Šajā pētījumā tika izmantoti divi dažādi MAMP: flg22 (Genscript kataloga nr. RP19986) un hitīns. Sorgo augi tika audzēti ieliktņos, kas novietoti uz plakaniem traukiem, kas piepildīti ar augsni (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) siltumnīcā. Augi tika laistīti dienu pirms paraugu ņemšanas, lai izvairītos no papildu lapu mitruma ņemšanas dienā.
Līnijas tika nejaušināti izvēlētas un loģistikas apsvērumu dēļ tika stādītas 60 līniju partijās. Katrai līnijai tika stādīti trīs "podi" ar divām sēklām katrā līnijā. Nākamās partijas tika stādītas, tiklīdz iepriekšējā partija bija apstrādāta, līdz bija novērtēta visa populācija. Abiem MAMP tika veikti divi eksperimentāli izmēģinājumi, katrā no tiem atkārtoti nejaušinot genotipus.
ROS testi tika veikti, kā aprakstīts iepriekš. Īsumā, katrai līnijai sešas sēklas tika iestādītas 3 dažādos podos. No iegūtajiem stādiem trīs tika atlasīti, pamatojoties uz viendabīgumu. Stādi, kas izskatījās neparasti vai bija ievērojami garāki vai īsāki par vairumu, netika izmantoti. No trīs dažādu 15 dienu vecu sorgo augu ceturtās lapas platākās daļas tika izgriezti četri lapu diski ar 3 mm diametru. Viens disks uz katru lapu no diviem augiem un divi diski no viena auga, otrajam diskam kļūstot par ūdens kontroli (skatīt zemāk). Diskus atsevišķi peldināja uz 50 µl H20 melnā 96 iedobju plāksnē, aizzīmogoja ar alumīnija blīvējumu, lai izvairītos no gaismas iedarbības, un turēja istabas temperatūrā nakti. Nākamajā rītā tika pagatavots reakcijas šķīdums, izmantojot 2 mg/ml hemiluminiscences zondi L-012 (Wako, kataloga nr. 120-04891), 2 mg/ml mārrutku peroksidāzes (VI-A tips, Sigma-Aldrich, kataloga nr. P6782) un 100 mg/ml hitīna vai 2 μM Flg22. 50 µl šī reakcijas šķīduma tika pievienoti trijām no četrām iedobēm. Ceturtā iedobe bija kontroles paraugs, kuram tika pievienots reakcijas šķīdums bez MAMP. Katrā plāksnē tika iekļautas arī četras tukšas iedobes, kas saturēja tikai ūdeni.
Pēc reakcijas šķīduma pievienošanas luminiscence tika mērīta, izmantojot SynergyTM 2 daudzfunkcionālo mikroplašu lasītāju (BioTek) ik pēc 2 minūtēm 1 stundas garumā. Plašu lasītājs veic luminiscences mērījumus ik pēc 2 minūtēm šīs 1 stundas laikā. Visu 31 nolasījuma summa tika aprēķināta, lai iegūtu katras iedobes vērtību. Katra genotipa MAMP atbildes paredzamā vērtība tika aprēķināta kā (trīs eksperimentālo iedobju vidējā luminiscences vērtība — izmēģinājuma iedobes vērtība) - mīnus vidējā tukšās iedobes vērtība. Tukšās iedobes vērtības vienmēr bija tuvas nullei.
Lapu diski noNicotiana benthamianaKvalitātes kontroles nolūkos katrā 96 iedobju plāksnē kā kontroles tika iekļauta arī viena augstas jutības sorgo līnija (SC0003) un viena zemas jutības sorgo līnija (PI 6069).
B. cookeiInokula sagatavošana un inokulācija
B. cookeiInokulu sagatavoja, kā aprakstīts iepriekš. Īsumā, sorgo graudus trīs dienas iemērcēja ūdenī, noskaloja, ievietoja 1 litra koniskās kolbās un autoklāvēja vienu stundu pie 15 psi un 121 °C temperatūras. Pēc tam graudus inokulēja ar aptuveni 5 ml macerētas micēlijas no svaigas kultūras.B. cookeiLSLP18 izolātus un atstāja uz 2 nedēļām istabas temperatūrā, ik pēc 3 dienām sakratot kolbas. Pēc 2 nedēļām ar sēnītēm inficētie sorgo graudi tika žāvēti gaisā un pēc tam uzglabāti 4 °C temperatūrā līdz lauka inokulācijai. Visā izmēģinājumā tika izmantots viens un tas pats inokulums, un katru gadu tas tika sagatavots svaigs. Inokulācijai 4–5 nedēļas vecu sorgo augu mieturī tika ievietoti 6–10 inficēti graudi. No šīm sēnēm saražotās sporas nedēļas laikā ierosināja infekciju jaunajos sorgo augos.
Sēklu sagatavošana
Pirms sēšanas laukā sorgo sēklas apstrādāja ar fungicīda, insekticīda un aizsarglīdzekļa maisījumu, kas saturēja ~1% Spirato 480 FS fungicīda, 4% Sebring 480 FS fungicīda un 3% Sorpro 940 ES sēklu aizsarglīdzekļa. Pēc tam sēklas 3 dienas žāvēja gaisā, veidojot plānu šī maisījuma kārtiņu ap sēklām. Aizsarglīdzeklis ļāva izmantot herbicīdu Dual Magnum kā pirmsdīgšanas apstrādi.
Mērķa lapu plankumu izturības novērtējums
SCP tika stādīts Centrālajā kultūraugu pētniecības stacijā Kleitonā, Ziemeļkarolīnā, 2017. gada 14. un 15. jūnijā un 2018. gada 20. jūnijā, izmantojot nejaušinātu pilna bloka dizainu ar diviem eksperimentāliem atkārtojumiem katrā gadījumā. Eksperimenti tika stādīti 1,8 m atsevišķās rindās ar 0,9 m rindu platumu, izmantojot 10 sēklas katrā lauciņā. Ap katra eksperimenta perifēriju tika stādītas divas robežrindas, lai novērstu malu efektus. Eksperimenti tika inokulēti 2017. gada 20. jūlijā un 2018. gada 20. jūlijā, kad sorgo augi bija 3. augšanas stadijā. Vērtējumi tika veikti skalā no viena līdz deviņiem, kur augi, kuriem nebija slimības pazīmju, tika novērtēti ar deviņi, bet pilnībā atmiruši augi - ar vienu. Divi vērtējumi tika veikti 2017. gadā un četri nolasījumi 2018. gadā, sākot divas nedēļas pēc inokulācijas katru gadu. sAUDPC (standartizētā platība zem slimības progresēšanas līknes) tika aprēķināts, kā aprakstīts iepriekš.
Publicēšanas laiks: 2021. gada 1. aprīlis